Myriam Consuelo López Páez - Enfoque clínico y de pruebas diagnósticas en parasitología

Fuente: cortesía de Olga Lucía Morales Reyes.

1. Agregar 100 µl de la solución reguladora de revestimiento en cada pozo con el antígeno secretorio/excretorio de Toxocara canis.

2. Incubar las microplacas en cámara húmeda a temperatura ambiente durante 3 horas.

3. Lavar tres veces con solución reguladora de PBS-T20 durante 5 minutos por cada lavado.

4. Agregar 100 µl de las diluciones de los sueros problema. Las muestras se sirven por triplicado. Dejar seis pozos de la placa libres de suero; estos pozos se utilizan como control de antígeno (tres de ellos) y control de conjugado (los tres restantes). Los seis pozos de control se llenan con 100 µl de solución reguladora de PBS-T20. Incubar en cámara húmeda a temperatura ambiente durante 2 horas.

5. Lavar tres veces con solución reguladora de PBS-T20 durante 5 minutos por cada lavado.

6. Agregar 100 µl de la dilución del conjugado en cada pozo, excepto en los tres pozos que sirven como control de antígeno; estos pozos se llenan con 100 µl de solución reguladora de PBS-T20. Incubar en cámara húmeda a 4 °C durante 18 horas.

7. Lavar tres veces con solución reguladora de PBS-T20 durante 5 minutos por cada lavado.

8. Agregar 100 µl de la solución de sustrato en cada uno de los pozos.

9. Incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos y detener la reacción añadiendo 25 µl de NaOH 3N a cada pozo.

10. Leer la absorbancia en espectrofotómetro a una longitud de onda de 405 nm. Confrontar las lecturas obtenidas con el valor de punto de corte establecido, revisar los resultados del control positivo y negativo y hacer el reporte correspondiente.

Los resultados se reportan como reactivo (RE) o no reactivo (NR), colocando en todos los casos el valor numérico de la absorbancia. El formato de reporte de resultados debe incluir un párrafo de interpretación que especifique el punto de corte de la técnica. Los valores de absorbancia iguales o mayores que 0.4 se consideran positivos, mientras que valores de absorbancia menores que 0.4 son negativos.

Método de Graham o de la cinta engomada

Este método se fundamenta en el hecho de que la hembra adulta de Enterobius vermicularis no deposita sus huevos en el interior del intestino del humano, sino que durante la noche migra hacia las márgenes del ano y deposita los huevos en los pliegues perianales. Por esta razón, se le debe indicar al paciente que no puede bañarse antes de defecar el día de la colecta y la muestra se debe tomar en horas de la mañana. A fin de aumentar la sensibilidad de la técnica, se pueden tomar tres muestras en días diferentes de la semana (24).

Con esta técnica se pueden observar huevos de otros parásitos como Taenia spp., Ascaris lumbricoides, Trichuris trichiura e Hymenolepis nana, entre otros.

Materiales y reactivos para la obtención y la lectura de la muestra

Los materiales y reactivos necesarios para este método son: guantes de látex, cinta adhesiva transparente, bajalenguas, portaobjetos y microscopio.

Procedimiento

En la figura 1.3, se esquematiza el procedimiento para la obtención de la muestra del método de Graham o cinta engomada.

Figura 1.3. Procedimiento para la toma de muestra del método de Graham.

Fuente: cortesía de Juan Edwin Villalobos Ospina.

1. Colocar la cinta transparente, con la parte adherente hacia fuera, sobre un extremo del bajalenguas. La cinta se sujeta con ayuda de los dedos pulgar e índice. El tamaño de la cinta debe ser de aproximadamente 13 cm de largo por 2 cm de ancho.

2. Hacer varias aplicaciones en la superficie de la región perianal del paciente.

3. Separar con cuidado la cinta del bajalenguas y colocarla sobre un portaobjetos, evitando la formación de burbujas.

4. Observar al microscopio con objetivo de 10X.

Según la OMS, los protozoos intestinales son la segunda causa de morbilidad y mortalidad en menores de 5 años. Dentro de este grupo se encuentran principalmente Entamoeba histolytica, Giardia duodenalis y Cryptosporidium spp. Existen otros parásitos intestinales menos frecuentes como Balantidium coli, Cystoisospora belli, Cyclospora cayetanensis y Blastocystis hominis, que también producen patología en humanos. Por otra parte, existen protozoos en el intestino considerados comensales no patógenos, tales como Endolimax nana, Iodamoeba butschlii, Entamoeba hartmanni, Entamoeba dispar, Entamoeba coli, Chilomastix mesnili y Trichomona hominis (25-28).

Dentro de la gran variedad de parásitos que afectan a los niños, los protozoos intestinales suelen ser de difícil identificación, debido a la variabilidad en la cantidad de formas de resistencia (quistes y ooquistes) eliminadas en la materia fecal o la dificultad en la detección de los trofozoítos, pues por lo general, las muestras no llegan al laboratorio en buenas condiciones o no se examinan durante el lapso de tiempo adecuado. El diagnóstico de estas patologías se hace por medio de exámenes directos, de concentración, pruebas inmunológicas, cultivos y pruebas moleculares (25-28).

El examen directo de materia fecal es el método de elección para identificar las formas parasitarias (quistes y trofozoítos) de amibas y flagelados intestinales como Entamoeba histolytica, Entamoeba dispar, Entamoeba moshkovskii, Iodamoeba butschlii, Endolimax nana, Entamoeba coli, Entamoeba hartmanni, Giardia duodenalis, Chilomastix mesnili, Trichomona hominis, Blastocystis hominis y Balantidium coli (8,9).

Recolección de la muestra

La toma de muestra de materia fecal debe hacerse directamente desde el paciente y no desde el suelo o la taza sanitaria; los recipientes de la recolección deben estar limpios y facilitar el transporte seguro de la muestra. A fin de preservar los trofozoítos, se debe evitar el contacto de la muestra con la orina (7).

En caso de disentería, es importante examinar la muestra en los primeros 20 minutos después de la recolección; pasado ese tiempo, los trofozoítos comienzan la autolisis, lo que dificulta la identificación de Entamoeba histolytica. Si se observan zonas con moco y sangre, se prefiere que el examen microscópico se realice en ellas, ya que existe mayor probabilidad de encontrar los trofozoítos de E. histolytica o Balantidium coli (7).

Examen directo en solución salina fisiológica

Materiales y reactivos

Los materiales y reactivos necesarios para este método son: portaobjetos, cubreobjetos y solución salina al 0.85 % (ver anexo 1) (8,9).

Procedimiento

1. Colocar una gota de solución salina sobre un portaobjetos.

2. Tomar pequeñas cantidades de materia fecal de diferentes partes de la muestra con el extremo de un aplicador.

3. Homogenizar la materia fecal tomada con el aplicador en la gota de solución salina.

4. Colocar un cubreobjetos y observar al microscopio con objetivos de 10X y 40X.

El examen directo en solución salina es útil para observar trofozoítos en movimiento, quistes y ooquistes.

Examen directo en solución de yodo o lugol

Materiales y reactivos

Los materiales y reactivos necesarios para este método son: portaobjeto, cubreobjetos y lugol (ver anexo 2) (8,9).

Procedimiento

Seguir los pasos descritos para el examen en solución salina fisiológica, pero en lugar de la solución salina, emplear una gota de solución yodada o lugol. Con esta técnica, se visualizan estructuras de los quistes y ooquistes, como los depósitos de glucógeno de color pardo rojizo, el citoplasma de coloración amarilla y el núcleo con la morfología característica de cada especie. Los trofozoítos se inmovilizan y se deforman de manera considerable.