Myriam Consuelo López Páez - Enfoque clínico y de pruebas diagnósticas en parasitología

10. Colocar los portaobjetos horizontalmente sobre un soporte metálico e introducirlos en un recipiente con alcohol yodado durante 18 horas a temperatura ambiente.

11. Servir los alcoholes al 30 %, 50 %, 70 %, 85 %, 95 % y 100 % en su respectivo recipiente marcado y tapado.

12. Preparar el alumbre férrico.

13. Pasar los portaobjetos del alcohol yodado a etanol al 50 % durante 3 minutos; luego, a un recipiente con agua destilada durante 3 minutos, y por último, al recipiente con alumbre férrico durante 1 hora.

14. Preparar la hematoxilina al 5 %.

15. Preparar el ácido pícrico.

16. Colocar las placas en un recipiente con agua destilada durante 1 hora.

17. Colocar las placas en la solución de trabajo de hematoxilina al 5 % durante 2 horas. Si la solución de trabajo de la hematoxilina es de buena calidad, las placas tomarán un color morado.

18. Colocar las placas en un recipiente con ácido pícrico durante 1 minuto para decolorar. Tener cuidado de no exceder este tiempo.

19. Colocar las placas en un recipiente y dejarlo bajo el chorro de agua del grifo durante 30 minutos.

20. Pasar las placas por los recipientes con las diferentes concentraciones de alcohol de la siguiente forma: etanol al 30 % durante 15 minutos, etanol al 50 % durante 15 minutos, etanol al 70 % durante 30 minutos, etanol al 85 % durante 15 minutos, etanol al 95 % durante 25 minutos y etanol al 100 % durante 15 minutos.

21. Usar guantes y tapabocas para colocar las placas en xilol en un recipiente tapado adecuadamente. Evitar el contacto directo del xilol con la piel.

22. Sacar uno por uno los portaobjetos del recipiente con xilol y sin dejarlos secar, poner una o dos gotas de citorresin sobre el extremo del extendido. De inmediato, colocar una laminilla, hacer presión y permitir que la solución se difunda. Limpiar los excedentes de los bordes con una gasa antes de dejar secar.

23. Observar al microscopio de luz con objetivos de 10X, 40X y 100X.

Tinción tricrómica

Al igual que la tinción de hematoxilina férrica, la tinción tricrómica permite observar las estructuras morfológicas de quistes y trofozoítos (28,38,39), como se puede ver en la tabla 1.3 .

Materiales y reactivos

Los materiales y reactivos necesarios para este método son: tubo de cultivo de amibas o materia fecal, gasa, vasos desechables, tubos, centrífuga, agua destilada, papel secante, aplicadores, portaobjetos, soporte metálico, cubreobjetos, recipientes rectangulares con tapa, guantes desechables, tapabocas, fijador de Schaudinn (ver anexo 19) o solución fijadora PVA (ver anexo 20), solución de albúmina (ver anexo 22), colorante tricrómico (ver anexo 27), solución saturada de alcohol yodado (ver anexo 23), etanol al 30 %, 50 %, 70 %, 85 % y 90 % (ver anexo 21), alcohol al 90 % acidificado (ver anexo 28), xilol y líquido de montaje (citorresin).

Procedimiento para realizar la tinción tricrómica con fijador de Schaudinn

1. Mezclar una parte de heces recién emitidas con tres partes de fijador de Schaudinn y fijar a 50 °C durante 5 minutos o 1 hora a temperatura ambiente.

2. Filtrar la mezcla anterior con un trozo de gasa.

3. Centrifugar el filtrado a 800 g durante 10 minutos.

4. Eliminar el sobrenadante, resuspender el sedimento con agua destilada y centrifugar a 800 g durante 10 minutos. Repetir este procedimiento mínimo tres veces o hasta obtener un sobrenadante transparente.

5. Montar los portaobjetos. Escurrir bien el líquido del tubo, colocarlo boca abajo sobre un papel secante durante unos pocos segundos y agregar algunas gotas de solución de albúmina con el fin de disolver el sedimento (entre cuatro y cinco gotas, por lo general).

6. Tomar una gota del preparado, colocarla sobre una lámina y extenderla horizontalmente con un aplicador hasta obtener una película delgada.

7. Dejar secar el extendido a temperatura ambiente durante 1 hora.

8. Colocar los portaobjetos horizontalmente en un soporte metálico e introducirlos en un recipiente con solución saturada de alcohol yodado durante 1 minuto.

9. Colocar los portaobjetos en alcohol al 70 % durante 1 minuto. Repetir este paso dos veces.

10. Colocar los portaobjetos en el colorante tricrómico de 2 a 8 minutos.

11. Colocar los portaobjetos en alcohol al 90 % acidificado de 10 a 20 segundos o hasta que haya decoloración completa.

12. Colocar los portaobjetos en alcohol al 95 % y enjuagar dos veces.

13. Colocar los portaobjetos en xilol durante 1 minuto.

14. Realizar el montaje con bálsamo o cualquier otro líquido de montaje como citorresin.

Procedimiento para realizar la tinción tricrómica con fijador de alcohol polivinílico

1. Mezclar una parte de heces recién emitidas con tres partes del fijador PVA hasta el momento de la coloración.

2. Tomar una gota del preparado, colocarla sobre los portaobjetos y extenderla horizontalmente con un aplicador hasta obtener una película delgada.

3. Dejar secar el extendido a temperatura ambiente durante 1 hora.

4. Colocar los portaobjetos en sentido horizontal en un soporte metálico e introducirlos en un recipiente con alcohol yodado durante 10 minutos.

5. Sumergir los portaobjetos en alcohol al 70 % de 3 a 5 minutos y repetir este paso dos veces.

6. Colocar los portaobjetos en el colorante tricrómico de 6 a 8 minutos.

7. Colocar los portaobjetos en alcohol al 90 % acidificado de 10 a 20 segundos o hasta que haya decoloración completa.

8. Colocar los portaobjetos en alcohol al 95 % y enjuagar.

9. Colocar los portaobjetos en alcohol al 95 % durante 5 minutos.

10. Colocar los portaobjetos en xilol de 5 a 10 minutos.

11. Realizar el montaje con bálsamo o cualquier otro líquido de montaje como citorresin.

Biopsia

El uso de exámenes endoscópicos de colon y recto permite la visualización directa de la lesión sugestiva en caso de cuadro clínico compatible con alguna forma de amibiasis intestinal (7). A su vez, este abordaje posibilita la toma de muestra de tejido de una o más lesiones, con el fin de realizar estudios histopatológicos (8,28,32). Los trofozoítos de E. histolytica se identifican a partir de la coloración del tejido con hematoxilina-eosina, pero en algunas ocasiones se requiere de la tinción tricrómica para diferenciar el trofozoíto de otras células.

Pruebas inmunológicas

Detección de Gal-NAc antilectina

La detección de Gal-Nac antilectina, es una técnica que posibilita la diferenciación entre la especie E. histolytica y la E. dispar a partir de muestras de materia fecal o aspirado de líquido del absceso hepático. En la actualidad, este método solo se encuentra disponible en algunos laboratorios de referencia y no se utiliza como prueba de rutina por sus altos costos (40,41).

Materiales y reactivos

Para este método, se utiliza el kit comercial de Techlab® T5017/30404 (42).

Recolección y manejo de las muestras

La muestra debe ser fresca, recién emitida o almacenada a una temperatura entre 2 °C y 8 °C y la prueba debe llevarse a cabo en las primeras 24 horas luego de la recolección. No deben usarse especímenes fecales recogidos o almacenados en fijadores como formalina al 10 %, solución acética y formol (SAF) o solución fijadora PVA. El congelamiento y descongelamiento de la muestra, sobre todo si se hace más de una vez, puede dar como resultado la pérdida de actividad, debido a la degradación de la adhesina.

Preparación de la muestra

Agregar entre 0.15 g y 0.20 g de materia fecal formada, 400 µl de materia fecal líquida o 400 µl de líquido de absceso hepático a un tubo marcado y añadir 400 µl de diluyente. Finalmente, mezclar en vórtex.

Procedimiento

1. Seleccionar un pozo de la placa de microtitulación como control negativo; otro, como control positivo y otro para la muestra.