Myriam Consuelo López Páez - Enfoque clínico y de pruebas diagnósticas en parasitología

La presencia de una banda de precipitación se considera una reacción positiva. El título de la muestra está definido por la última dilución en la cual se observa esta banda.

Ensayo inmunoenzimático

Como se explicó en el aparte sobre el diagnóstico de Toxocara canis usando la técnica ELISA, esta prueba permite determinar la concentración de un antígeno o un anticuerpo en la muestra, mediante el uso de uno de ellos en fase sólida y el otro, en solución. La detección de la reacción antígeno-anticuerpo se realiza con una enzima (fosfatasa alcalina, peroxidasa, glucosa oxidasa o beta-D-galactosidasa) que reacciona con un sustrato específico y, de acuerdo con este mismo sustrato, se detiene la reacción usando ácidos o bases fuertes. La concentración de los productos enzimáticos se obtiene a través de la lectura de la densidad óptica en espectrofotómetro a la longitud de onda en la cual el color formado presenta su máxima absorción (58).

La detección de anticuerpos es la técnica que se usa con mayor frecuencia en Colombia. En el caso particular de la detección de anticuerpos anti-E. histolytica, el antígeno preparado a partir de cultivos axénicos de la cepa HM1:IMSS se fija en la fase sólida y luego se agrega la muestra (suero) en la que se sospecha que está el anticuerpo a determinar. Más adelante, se agrega el conjugado (anticuerpo marcado con fosfatasa alcalina) dirigido contra el anticuerpo específico. Posteriormente, se añade el sustrato de la enzima, produciéndose una reacción colorimétrica cuantificada con espectrofotómetro. Al estandarizar la prueba, se establece el punto de corte con el cual se indica la positividad o negatividad de la muestra (55). A continuación, se describen las condiciones de trabajo estandarizadas en Colombia para esta prueba.

Materiales y reactivos

Los materiales y reactivos necesarios para esta técnica son: placas de poliestireno de 96 pozos Immulon I, papel secante, nevera, cronómetro, micropipetas automáticas y puntas, frasco lavador, antígeno de E. histolytica (ver anexo 42), solución reguladora de revestimiento 0.05 M pH 9.6 (ver anexo 12), solución reguladora de fosfato (PBS) 0.15 M pH 7.4 (10X) (ver anexo 13), solución reguladora de fosfato (PBS) 0.15 M pH 7.4 más Tween 20 (PBS-T20) (ver anexo 14), solución reguladora de dietanolamina pH 9.8 (ver anexo 15) e hidróxido de sodio 3N (ver anexo 16).

Condiciones de trabajo utilizadas en Colombia

A continuación, se presentan las condiciones de trabajo estandarizadas en el laboratorio, para la realización del ELISA.

• Antígeno: se prepara a partir de cultivos axénicos de la cepa HM1:IMSS. La concentración de trabajo estandarizada para ELISA es de 1.25 µg/ml.

• Suero: la dilución estandarizada de suero es de 1:400, es decir, una parte de suero por 400 partes de solución de trabajo PBS-T20. Esta dilución es la misma para las muestras problema y los sueros controles (positivo y negativo).

• Conjugado: anti-IgG humana marcada con fosfatasa alcalina en una dilución de 1:15 000, es decir, una parte de conjugado por 15 000 partes de solución de trabajo PBS-T20. Esta concentración puede ser ajustada en función de la marca del anticuerpo conjugado.

• Sustrato: el sustrato de la fosfatasa alcalina es una solución de paranitrofenilfosfato en solución reguladora de dietanolamina pH 9.8, en proporción 1:1 w/v (1 mg de sustrato/1 ml de solución). La reacción se detiene con NaOH 3N.

• Punto de corte: el punto de corte de esta prueba diagnóstica es 0.34. Muestras con absorbancias mayores o iguales a 0.34 son consideradas positivas.

Procedimiento

1. Agregar 100 µl de la solución reguladora de revestimiento en cada pozo con el antígeno de E. histolytica.

2. Incubar las microplacas en cámara húmeda a temperatura ambiente durante 3 horas.

3. Lavar tres veces con solución reguladora de PBS-T20 durante 5 minutos por cada lavado.

4. Agregar 100 µl de las diluciones de los sueros problema. Las muestras se sirven por triplicado. Se dejan seis pozos de la placa libres, de los cuales tres serán utilizados como control de antígeno y los tres restantes, control de conjugado. Los seis pozos de control se llenan con 100 µl de solución reguladora de PBS-T20. Incubar en cámara húmeda a temperatura ambiente durante 2 horas.

5. Lavar tres veces con solución reguladora de PBS-T20 durante 5 minutos por lavado.

6. Agregar 100 µl de la dilución del conjugado en cada pozo, excepto en los tres pozos que sirven como control de antígeno; estos pozos se llenan con 100 µl de solución reguladora de PBS-T20. Incubar en cámara húmeda a 4 °C durante 18 horas.

7. Lavar tres veces con solución reguladora de PBS-T20 durante 5 minutos por cada lavado.

8. Agregar 100 µl de la solución de sustrato en cada uno de los pozos.

9. Incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos y detener la reacción añadiendo 25 µl de NaOH 3N a cada pozo.

10. Leer la absorbancia en un espectrofotómetro a una longitud de onda de 405 nm. Confrontar las lecturas obtenidas con el valor de punto de corte establecido, revisar los resultados del control positivo y negativo y hacer el reporte correspondiente.

Los resultados se reportan como reactivo (RE) o no reactivo (NR), colocando en todos los casos el dato de la absorbancia. El formato debe incluir un párrafo de interpretación que especifique el punto de corte de la técnica empleada. Se consideran valores de absorbancia positivos mayores o iguales a 0.34, mientras que los valores de absorbancia menores a esta cifra son negativos. En la figura 1.2 se esquematiza el procedimiento ELISA indirecto para la detección de anticuerpos tipo IgG anti-E. histolytica.

Hemaglutinación indirecta

En esta técnica se utilizan glóbulos de carnero previamente tratados con ácido tánico y sensibilizados con antígeno de E. histolytica en presencia del suero problema con sospecha de amibiasis (59).

Materiales y reactivos

Los materiales y reactivos necesarios para esta técnica son: antígeno de E. histolytica (ver anexo 42), glóbulos rojos, glutaraldehído al 1 % (ver anexo 43), solución salina al 0.85 % (ver anexo 1), PBS pH 7.2 (ver anexo 44), ácido tánico en dilución 1:15 000 (ver anexo 45) y azida de sodio al 1 % (ver anexo 46).

Procedimiento

▪ Tratamiento de las células rojas con glutaraldehído

1. Centrifugar la sangre total de carnero por 3 minutos a 800 g.

2. Lavar los glóbulos rojos tres veces con solución salina al 0.85 % a 800 g durante 5 minutos.

3. Mezclar el precipitado con glutaraldehído al 1 %.

4. Incubar a 4 °C en agitación durante 30 minutos (agitador magnético).

5. Eliminar el glutaraldehído por centrifugación.

6. Lavar los glóbulos rojos cinco veces con agua destilada y cinco veces con solución salina fría al 0.85 %.

7. Utilizar las células en solución salina para preparar una dilución de células al 20 % con azida de sodio al 1 % y almacenar a 4 °C.

▪ Tratamiento de las células rojas con ácido tánico

1. Centrifugar las células rojas mantenidas en azida de sodio al 1 % durante 10 minutos a 800 g para concentrarlas al 100 %.

2. Diluir las células a una concentración de 2 % con solución salina fría al 0.85 %.

3. Mezclar la solución de células al 2 % y el ácido tánico 1:15 000 en proporción 1:1 (volumen a volumen o v/v).

4. Incubar a 37 °C durante 40 minutos.

5. Centrifugar a 800 g durante 10 minutos y lavar dos veces con solución salina fría al 0.85 % para eliminar el exceso de ácido tánico y concentrar los glóbulos rojos al 100 %.

▪ Sensibilización de glóbulos rojos

1. Diluir el antígeno de E. histolytica a su concentración óptima utilizando PBS pH 7.2.

2. Diluir los glóbulos rojos tratados con ácido tánico y concentrados al 100 % en la dilución óptima del antígeno hasta obtener una concentración de células del 2 %.