Myriam Consuelo López Páez - Enfoque clínico y de pruebas diagnósticas en parasitología

Tabla 1.1. Clasificación de las intensidades de infección por diferentes helmintos según el conteo de huevos.

Materiales y reactivos

Los materiales y reactivos necesarios para este método son: tiras de papel celofán hidrofílico 25 mm x 30 mm de 40 µm-50 µm de espesor, portaobjetos, placa de plástico de 3 cm x 4 cm con un orificio central de 6 mm de diámetro, 1.37 mm de profundidad y capacidad de 50 mg de materia fecal, espátula de plástico pequeña, papel craft o periódico, tela de nylon con 105 perforaciones por milímetro cuadrado, verde de malaquita al 3 % (ver anexo 5), glicerina, agua destilada, guantes, pinzas y marcadores.

Procedimiento

La figura 1.1 esquematiza el procedimiento de la realización de la técnica Kato-Katz.

Figura 1.1. Procedimiento para la realización de la técnica de Kato-Katz.

Fuente: cortesía de Juan Edwin Villalobos Ospina.

1. Mezclar la glicerina y el verde de malaquita y colocar el papel de celofán en esta solución durante 24 horas antes de hacer los montajes de la muestra de materia fecal.

2. Colocar una pequeña muestra de materia fecal sobre papel craft o sobre papel periódico.

3. Colocar la tira de nylon sobre la materia fecal y presionar.

4. Colocar la placa de plástico sobre un portaobjetos.

5. Recolectar la materia fecal de la malla usando la espátula plástica y rellenar el orificio.

6. Retirar con cuidado la placa, dejando la materia fecal sobre el portaobjetos.

7. Colocar el papel celofán húmedo sobre la materia fecal como si fuera una laminilla e invertir el portaobjetos sobre un pedazo de papel craft, comprimiendo con suavidad.

8. Observar al microscopio después de 1 o 2 horas. Los huevos de Uncinarias spp. se vuelven transparentes, por lo que se dificulta su identificación. El recuento microscópico se realiza por toda la superficie de la tira de papel celofán. El resultado del recuento de huevos de Ascaris lumbricoides, Trichuris trichiura y Uncinarias spp. se multiplica por 24, que corresponde a h.p.g. Si se visualizan o investigan otros parásitos como Enterobius vermicularis, Strongyloides stercoralis o Taenia spp., se informan resultados cualitativos (positivo o negativo).

La técnica se basa en el desplazamiento de las larvas de Strongyloides en agar nutritivo, formando canales que se pueden identificar macroscópicamente (14,15).

Materiales y reactivos

Los materiales y reactivos necesarios para este método son: agar (ver anexo 6), cajas de Petri, formol al 10 % (ver anexo 3), gradilla, bajalenguas, marcadores, papel Parafilm® y centrífuga.

Procedimiento

1. Marcar la caja de Petri.

2. Colocar 2 g de materia fecal en el centro de la caja de Petri con el agar.

3. Sellar la caja con papel Parafilm®.

4. Dejar la caja a una temperatura entre 25 °C y 33 °C durante 48 horas.

5. Observar a simple vista o al microscopio.

6. Reportar si se observan canales en el agar.

7. Agregar 10 ml de formol al 10 % y lavar la superficie del agar.

8. Recolectar la suspensión en un tubo y centrifugar a 500 g por 5 minutos.

9. Realizar un montaje directo en solución salina y lugol.

10. Observar al microscopio y reportar los parásitos observados.

El fundamento de la técnica es favorecer la embrionación de huevos y la separación de larvas de nemátodos sobre papel de filtro; cuando hay tremátodos y céstodos, se pueden observar los huevos embrionados (16).

Materiales y reactivos

Los materiales y reactivos necesarios para este método son: tubos de ensayo de 16 mm x 15 mm, papel de filtro de 14 cm de largo y 1 cm de ancho, agua destilada estéril, formol al 10 % (ver anexo 3), gradilla, bajalenguas, marcadores, incubadora y centrífuga.

Procedimiento

1. Homogenizar 2 g de materia fecal con 0.5 ml de agua destilada estéril.

2. Con el bajalenguas, esparcir la materia fecal homogenizada sobre los 10 cm centrales de la tira de papel de filtro. Dejar libres 2 cm en cada extremo del papel de filtro.

3. Introducir la tira de papel sembrada en un tubo previamente marcado, que contiene 5 ml de agua destilada estéril; evitar que la zona con la muestra tenga contacto con el agua.

4. Cerrar el tubo y colocarlo en una gradilla.

5. Incubar a 20 °C durante 72 horas.

6. Descartar la tira de papel filtro y agregar 0.5 ml de formol al 10 %.

7. Centrifugar a 500 g por 5 minutos.

8. Realizar un montaje directo en solución salina y lugol.

9. Examinar al microscopio y reportar los parásitos observados.

El propósito de este aparte es sugerir diferentes metodologías, basadas en fundamentos distintos para realizar el diagnóstico de toxocariasis.

Ensayo inmunoenzimático

La técnica de ensayo inmunoenzemático (ELISA, por su sigla en inglés) permite determinar la concentración del antígeno o del anticuerpo mediante el uso de uno de ellos en fase sólida y el otro en solución; el complejo antígeno-anticuerpo se detecta a través de una enzima que reacciona con su sustrato. Las enzimas más utilizadas son fosfatasa alcalina, peroxidasa, glucosa oxidasa y beta-D-galactosidasa. La reacción enzimática se detiene en la fase lineal de la curva con la incorporación de ácidos o bases fuertes, según el tipo de sustrato. La cantidad de producto formado en la reacción se mide en un espectofotómetro, al leer la densidad óptica a la longitud de onda, en la cual el color generado tiene su máxima absorción (17-23).

En Colombia, esta técnica se usa con mayor frecuencia para la búsqueda de anticuerpos. En este caso, el antígeno se fija a la fase sólida y luego se agrega la muestra en la que se sospecha que se encuentra el anticuerpo específico. A continuación, se agrega otro anticuerpo dirigido contra el anticuerpo específico de interés; este segundo anticuerpo está unido o conjugado a la enzima. Finalmente, el sustrato de la enzima se incorpora en la placa, con lo que se produce una reacción colorimétrica que se cuantifica con espectrofotómetro. Durante el proceso de estandarización de la prueba de ELISA, se establece el punto de corte que sirve de referencia para determinar si la muestra analizada es positiva o negativa (17-23).

Obtención de parásitos adultos de Toxocara canis y embrionación de los huevos

La obtención de parásitos adultos y la embrionación de los huevos de Toxocara canis son un procedimiento importante en la producción del antígeno secretor/ excretor usado en la técnica ELISA para la detección de anticuerpos (23). Para la obtención de los adultos de T. canis, se sugiere elegir alguna de las siguientes opciones y llevarla a cabo:

1. Entrar en contacto con centros veterinarios que realicen diagnóstico parasitológico y puedan proporcionar los especímenes una vez los caninos hayan sido sometidos a tratamiento antihelmíntico.

2. Entrar en contacto con centros de zoonosis, a fin de que proporcionen los parasitos adultos de T. canis postratamiento o por procedimientos de necropsia.

3. Infectar caninos experimentalmente con huevos de T. canis bajo condiciones de bioterio y obtener los adultos por procedimientos estandarizados y reglamentados en los protocolos de bioética y bienestar animal establecidos en la normatividad nacional e internacional.