José F. Pertusa Grau - Técnicas de análisis de imagen, (2a ed.)

Por otra parte, el estudio de estos métodos tiene el interés adicional de que constituyen el nexo natural con la estereología y que su estudio nos permitirá reflexionar sobre problemas geométricos y espaciales que, en ocasiones, parecen estar abandonados en las técnicas ordinarias de análisis de imagen asistido por computadora. Decimos que este conjunto de métodos de medida se encuentra muy próximo a la estereología porque se implementaron lejos de la tecnología digital del análisis de imagen, con una gran base geométrica, un claro objetivo cuantitativo y, justamente, para poder inferir información tridimensional a partir de cortes histológicos. Por estos motivos algunos colegas los consideran los auténticos métodos biológicos de medida. Nosotros no queremos ser tan taxativos porque somos conscientes de que los métodos computerizados aportan tantas y tan buenas soluciones, que sería un tanto irreflexivo negar sus ventajas. De todas maneras, los métodos que estudiaremos a continuación pueden sacarnos de algún que otro apuro cuando, por ejemplo, nuestro ordenador se niegue a seguir nuestras instrucciones.

2.2 Estimación del área

2.2.1 Aproximaciones geométricas

El cálculo del área de un objeto puede ser algo muy sencillo cuando el objeto se aproxima a una figura geométrica regular. La geometría nos facilita el cálculo de superficies de objetos regulares, circulares o rectangulares por ejemplo, a partir de su radio o de la longitud de sus lados. Pero este no suele ser el caso más frecuente y la aproximación a una figura de geometría regular no está exenta de cierta imprecisión, dependiendo de la forma del objeto y la capacidad de apreciación del observador.

Con un sencillo ejemplo podemos ilustrar cuándo sería aplicable el método basado en la aproximación a una figura geométrica regular. Supongamos que queremos averiguar el volumen de sangre que circula por un segmento de la arteria aorta de un centímetro de longitud; para ello disponemos de dos cortes transver-sales de sendas aortas fijadas en contracción y relajación (en sístole y diástole cardiaca), porque la presión sanguínea hace que se deforme la pared elástica de la arteria y es evidente que los momentos cumbres de máximo y mínimo contenido corresponderán a los volúmenes arteriales en ambas circunstancias 1 . La imagen real se parece mucho al esquema presentado en la fig. 2.1.

Fig. 2.1 Idealización de la sección transversal de una arteria en estado de máxima dilatación (izquierda) y en relajación (derecha).

Nótese que la sección de la arteria se puede aproximar, en ambos casos, a un círculo, aunque más perfecto en la etapa de sístole que en la de diástole; la irregularidad apreciable en la diástole se debe a que, en este periodo, se produce un contorno festoneado en la arteria como consecuencia de la relajación de las fibras elásticas que forman la pared. Aun así podemos considerar que la luz de la arteria en ambos momentos se puede aproximar a un círculo, por lo que podremos estimar directamente en el microscopio, mediante un micrómetro ocular, o sobre imágenes fotográficas de las preparaciones, utilizando una sencilla regla, el diámetro interior de las aortas y aplicar la fórmula del área del círculo (A=πr 2). Pero esta forma de medir el diámetro esta sujeta a una buena dosis de subjetividad, ya que es el observador quien decide cuál es el diámetro de la aorta, que puede ser o no el diámetro real.

Para evitar en cierta medida esta subjetividad, se ha venido utilizado otro método que consiste en inscribir el objeto en un círculo de área conocida, mediante la superposición de una plantilla de círculos concéntricos al objeto. Es algo semejante a como se mide el diámetro del dedo en algunas joyerías que utilizan un conjunto de anillos de diferentes tamaños. La medida así obtenida se ha denominado, tradicionalmente, área del círculo equivalente y también se encuentra repleta de una buena dosis de subjetividad. El área del círculo equivalente ha tenido un uso muy generalizado en el pasado y dio lugar a pequeños instrumentos que facilitaban su estimación. Un fabricante de microscopios diseñó un pequeño diafragma para el ocular que permitía cerrar un anillo alrededor del objeto situado en el campo de observación; un lector en forma de regla, dispuesto en el exterior del ocular, proporcionaba al investigador la longitud del diámetro del diafragma en un momento dado y le permitía estimar el área del círculo equivalente.

También podríamos inscribir el objeto en un paralelepípedo en lugar de en un círculo. De esa manera mediríamos dos diámetros, los dos lados del rectángulo, con lo que podríamos utilizar el valor promedio para calcular el área del círculo promedio. Esta otra forma de proceder no supone ningún incremento de fiabilidad, pero sí que nos facilitaría la obtención de la medida de los diámetros porque es mucho más sencillo trazar un rectángulo que inscriba al objeto que ajustar una circunferencia a lo largo de todo su perímetro.

2.2.2 Recuento de áreas unitarias

Podríamos limitar un poco más la subjetividad del observador complicando el sistema de medida mediante el trazado de un cuadrado que inscriba al objeto. En ese caso podríamos inscribir el objeto en esta figura geométrica, pero dividiendo, a su vez, el cuadrado en tantos otros pequeños cuadrados como fuésemos capaces de dibujar; Ahora deberíamos contar cuántos cuadraditos pequeños enteros caben dentro del perímetro del objeto; como sabremos el área de uno de ellos, la suma de todas las áreas será, aproximadamente, el área del objeto. Es obvio que este tipo de «papel milimetrado» nos permitiría aproximarnos al área total del objeto de manera más objetiva, teniendo como límite de apreciación el tamaño del cuadradillo más pequeño. Es un método más fiable pero muy laborioso. Ya veremos más adelante como la automatización ha solventado el problema del trabajo manual.

2.2.3 Método de la pesada

Pero en muchas ocasiones necesitamos la medida del área como parámetro comparativo entre dos lotes experimentales. En este caso la comparación de las áreas puede realizarse por medio de otros estimadores más sencillos y menos laboriosos. Pondremos como ejemplo un caso que contribuyó decisivamente al desarrollo de las técnicas automatizadas de medida.

En los inicios de la era industrial, las factorías del acero necesitaban disponer de una norma con la que clasificar la calidad de los aceros que estaban produciendo. Tal calidad dependía de la cantidad relativa de hierro y carbón en la aleación, con lo que los laboratorios de control de calidad se propusieron desarrollar un método con el que estimar la proporción de ambos componentes de la aleación, analizando el área relativa de ambos en una imagen microscópica. Un conjunto de técnicos preparaba las láminas de acero que eran fotografiadas al microscopio; las imágenes presentaban dos tipos de manchas de distinta tonalidad que correspondían al hierro y al carbón. A continuación se recortaban las manchas en las fotografías para hacer dos montones de retales, uno para cada tipo de componente. Como el grosor del papel fotográfico era el mismo en toda la foto y la cantidad de plata que daba el tono más o menos oscuro a cada mancha de los componentes era tan reducida como despreciable, la abundancia de cada componente era proporcional al peso de los retales de cada especie. Esta medida relativa se expresaba como una fracción, peso de uno partido por peso del otro, o como el valor porcentual de un peso y del otro respecto al peso total.