Jorge Luna Fontalvo - Métodos analíticos de microbiología general y aplicada

Figura 1. Morfología y agrupación de las células bacterianas.

El estudiante deberá, a partir de cada una de las tinciones que realice, determinar la morfología de las células bacterianas y su agrupación y observar endosporas. Así mismo estará en capacidad de identificar la reacción a la tinción de Gram y Ziehl-Neelsen.

•Cultivo de Escherichia coli.

•Cultivo de Klebsiella pneumoniae.

•Cultivo de Staphylococcus aureus.

•Cultivo de Bacillus cereus.

•Cultivo de Mycobacterium sp.

•Láminas portaobjetos.

•Asas de siembra.

•Solución de azul de metileno.

•Solución de violeta de genciana.

•Solución cristal violeta.

•Lugol.

•Alcohol acetona.

•Solución de fucsina.

•Solución de safranina al 0,25%.

•Solución de verde de malaquita al 7,6%.

•Solución de fucsina fenicada.

•Ácido-alcohol.

•Rejillas para tinción.

•Bandejas.

•Frascos lavadores con agua.

•Toallas de papel absorbente.

•Aceite de inmersión.

•Microscopios.

•Mecheros.

•Fósforos.

—Tome varios portaobjetos y, con ayuda de un marcador permanente de punta fina, trace pequeños espacios, los cuales serán utilizados para el rotulado de las preparaciones microscópicas.

—Deposite 1 ó 2 gotas de agua destilada en los espacios delimitados para los extendidos de los inóculos.

—Con ayuda del asa de siembra, previamente esterilizada en la llama del mechero, extraiga asépticamente una porción de la colonia bacteriana que se encuentra en los cultivos (S. aureus, E. coli, B. cereus, Mycobacterium tuberculosis) y deposítela en el centro del portaobjeto junto con las gotas de agua destilada.

—Extienda la porción de la colonia con la gota de agua en el portaobjeto utilizando el asa de siembra. Realice círculos sucesivos en el portaobjeto hasta cubrir todo el espacio delimitado para el extendido.

—Fije el extendido. Para esto deberá pasarlo por la llama del mechero levemente.

—­Realice todos los frotis bacterianos para las diferentes tinciones.

Figura 2. Procedimientos para la obtención de un frotis bacteriano.

—Tome los portaobjetos que contienen los frotis destinados para la tinción simple. Para este caso se recomienda trabajar con los frotis de las bacterias S. aureus y B. cereus.

—Deposite ahora los portaobjetos en la rejilla y proceda a teñirlos agregando sobre las muestras el colorante azul de metileno o violeta de genciana. Déjelos actuar por un minuto.

—Elimine el colorante y lave con agua. Seque con papel absorbente presionando suavemente los portaobjetos y luego exponiéndolos suavemente a la llama del mechero.

—Observe las preparaciones al microscopio, primero con los objetivos de menor aumento (10X, 40X), agregue una gota de aceite de inmersión y enfoque con el objetivo de inmersión (100X).

—Identifique la morfología y agrupación de las bacterias observadas y esquematícelas.

—Terminada la observación, elimine las preparaciones en la bandeja.

Figura 3. Procedimientos básicos para la tinción simple.

—Tome los portaobjetos que contienen los frotis destinados para la tinción de Gram. Para este caso se recomienda trabajar con los frotis de las bacterias E. coli, S. aureus y B. cereus.

—Deposite ahora los portaobjetos con su muestra fijada sobre la rejilla.

—Tiña con cristal violeta durante un minuto.

—Elimine el colorante y lave suavemente con agua.

—Aplique lugol (mordiente) durante un minuto.

—Elimine el lugol y lave con agua.

—Decolore con una solución de alcohol-acetona durante 10-30 segundos (el tiempo dependerá del grosor del frotis).

—Elimine el alcohol-acetona y lave con agua.

—Tiña con fucsina o safranina (contraste) por un minuto.

—Elimine el colorante de contraste y lave con agua.

—Seque con papel absorbente presionando suavemente los portaobjetos y luego expóngalos de forma muy suave a la llama del mechero.

—Observe las preparaciones al microscopio, primero con los objetivos de menor aumento (10X, 40X) y busque la zona donde depositó la muestra. Una vez logrado esto, enfoque con el objetivo de inmersión (100X) tal como lo hizo en la tinción simple.

—Termine la observación identificando la morfología, la agrupación y la reacción al Gram de las bacterias observadas y esquematícelas.

—Elimine las preparaciones en la bandeja.

Figura 4. Pasos de la tinción de Gram.

—Tome el portaobjeto que contiene el frotis para la tinción de Wirtz. Para este caso se trabajará con el extendido de la bacteria B. cereus.

—Deposite ahora el portaobjeto con su muestra fijada sobre la rejilla.

—Tiña de 6 a 8 minutos con verde de malaquita al 7,6% con calor del mechero y sin dejar secar el colorante.

—Elimine el colorante y lave con agua por 10 a 15 segundos.

—Tiña con una solución al 0,25% de safranina por quince segundos.

—Elimine la safranina y lave con agua.

—Seque con papel absorbente presionando suavemente el portaobjeto y luego expóngalo de forma muy suave a la llama del mechero.

—Observe con el objetivo de inmersión (100X) como de costumbre.

—Identifique las esporas bacterianas de manera libre (exosporas) o en su defecto las endosporas. Esquematice lo observado.

—Terminada la observación, elimine la preparación en la bandeja.

Figura 5. Procedimientos de la tinción de Wirtz.

—Tome el portaobjeto que contiene el frotis para la tinción de Zielh-Neelsen. Para este caso se trabajará con el extendido de la bacteria M. tuberculosis.

—Deposite ahora el portaobjeto con su muestra fijada sobre la rejilla.

—Cubra la preparación con fucsina fenicada y deje actuar por cinco minutos con calor del mechero hasta desprender vapores, pero sin dejar secar el colorante.

—Elimine el colorante y lave con agua de 10 a 15 segundos.

—Decolore con alcohol ácido durante 10-20 segundos.

—Elimine el alcohol ácido y lave con agua.

—Tiña con azul de metileno como colorante de contraste durante 2 minutos.

—Elimine el colorante y lave con agua de 10 a 15 segundos.

—Seque con papel absorbente presionando suavemente el portaobjeto y luego expóngalo de forma muy suave a la llama del mechero.

—Observe con el objetivo de inmersión (100X) como de costumbre.

—Identifique las células bacterianas AAR teñidas de color fucsia y esquematícelas.

—Terminada la observación, elimine su preparación en la bandeja.

Figura 6. Pasos de la tinción de Zielh-Neelsen.

Complete las siguientes tablas de acuerdo con las tinciones realizadas:

1.¿Cuáles son los dos propósitos de la fijación por calor?

A.

B.

2.¿Por qué los colorantes básicos son más apropiados para teñir bacterias que los colorantes ácidos?