Jorge Luna Fontalvo - Métodos analíticos de microbiología general y aplicada

Conocer la clasificación, preparación, esterilización y utilización de los medios de cultivo.

•Agar nutritivo deshidratado.

•Agar EMB deshidratado.

•Caldo nutritivo deshidratado.

•Matraces Erlenmeyer de 250 mL.

•Tubos de ensayo de 18 x 150 mm.

•Agua destilada.

•Placas de Petri estériles.

•Algodón y gasa.

•Espátula.

•Vidrios de reloj.

•Fósforos o encendedor.

•Mecheros.

•Cabina de flujo laminar.

•Autoclave.

•Baño de María.

•Balanza.

—­Pese las cantidades exactas para preparar 50 mL de caldo nutritivo y 100 mL de agar nutritivo.

—Disuelva las cantidades pesadas en el volumen correspondiente de agua destilada utilizando los matraces Erlenmeyer. El caldo nutritivo se disuelve fácilmente sin necesidad de calentar, mientras que para disolver el agar nutritivo será necesario calentar a baño de María por algún tiempo. El matraz deberá taparse con algodón y gasa para evitar evaporación y agitarse de vez en cuando para que la disolución sea uniforme. El medio estará disuelto cuando ya no haya formación de grumos y se observe transparente y no turbio.

—Dispense el caldo nutritivo en cantidades de 5 mL en tubos de ensayo y tápelos.

—Esterilice los medios de cultivo en autoclave a 15 lb de presión (121 °C) por quince minutos.

—Una vez esterilizados los medios, deje enfriar a temperatura ambiente los tubos que contienen caldo.

—Deje enfriar el agar contenido en el matraz a unos 45 °C (hasta tolerar en la palma de la mano) y en condiciones asépticas (cabina de flujo laminar). Distribúyalo en las cajas Petri estériles (15-20 mL en cada una).

—Una vez solidificados los medios, guarde los tubos y cajas en el refrigerador ya que serán empleados posteriormente, rotulándolos de forma adecuada.

1.¿Por qué se recomienda enfriar a 45 °C el agar antes de efectuar el vaciado en las cajas Petri?

2.¿Qué son medios de cultivos cromogénicos y fluorogénicos?

3.¿Qué ventajas tienen los medios de cultivos Petrifilm? Cite al menos tres ejemplos.

4.¿Cuál es la diferencia entre un medio de cultivo selectivo y un medio de cultivo electivo?

La técnica más usada en el laboratorio de microbiología es el traspaso o siembra de microorganismos de un ambiente a otro con el objetivo de: 1) permitir la sobrevivencia de los microorganismos, para lo que requieren un aporte continuo de nutrientes y una eliminación constante de sus productos de desecho, y 2) estudiar su estructura metabólica, bioquímica y función en sustratos.

El estudio de cualquier microorganismo requiere que se examine una sola especie a la vez. El método analítico no se puede aplicar cuando se tiene una mezcla de varias especies, es decir, un cultivo mixto. Por eso es necesario siempre trabajar con un cultivo puro, que se define como aquel que ha sido originado a partir de una sola célula. Idealmente, se debería aislar una sola bacteria y luego transferirla a un medio de cultivo estéril para que se multiplique hasta obtener una gran población, todas derivadas de una única bacteria parental. De esta manera todas las bacterias multiplicadas corresponden a clones que contienen la misma información genética, exceptuando aquellas que mutan de manera espontánea. A pesar de lo difícil que es aislar una sola célula, existen técnicas capaces de aproximar este ideal (Arias y Gómez, 2001).

El primer paso en el cultivo de los microorganismos es la siembra, la cual se puede realizar de diversas formas, ya sea a través de inoculaciones en superficie, profundidad o por agotamiento (Thatcher y Clard, 1993). Por tanto, todas estas técnicas varían de acuerdo con las características del microorganismo, el interés del investigador y el objeto final del estudio. Entre los métodos de siembra empleados para el estudio de las bacterias se encuentran:

•Siembra en medio líquido: este tipo de siembra se realiza en tubos de ensayos que contienen caldos. Generalmente se emplean para el mantenimiento y activación de cepas en el laboratorio, como también en la determinación de reacciones fermentativas, para lo cual el tubo de ensayo deberá contener en su interior un pequeño tubo invertido conocido como campana Durham. La siembra en medio líquido se realiza traspasando de un cultivo bacteriano, ya sea en medio sólido o líquido, a un nuevo tubo de ensayo que contiene el caldo estéril.

•Siembra en superficie con rastrillo: se emplea para el análisis de muestras de agua, suelo y alimento. Permite obtener colonias y estimar la densidad poblacional de microorganismos de metabolismo aerobio o facultativo. Por esta razón la siembra en superficie se relaciona directamente con la técnica del recuento directo en placa (recuento por dilución). Para esta siembra se maneja el asa o rastrillo de Digralsky, con el cual se extiende la alícuota de la muestra sobre la superficie del medio de cultivo sólido contenido en una placa de Petri.

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