Julio C. Rojas - Temas selectos en ecología química de insectos

Métodos en fisiología olfativa

Existen diferentes técnicas para el estudio de la fisiología del sistema olfativo a nivel periférico y a nivel central. Entre los métodos empleados a nivel periférico se cuenta el electroantenograma (EAG) y los registros de sénsulo único (RSU), ambas técnicas han sido abordadas previamente (Capítulo 1 de este libro).

Los registros electrofisiológicos a nivel periférico permiten identificar con relativa facilidad los constituyentes naturales de una mezcla de olor que los insectos son capaces de detectar, es decir los compuestos “activos”. Esta identificación sería extremadamente difícil, sino imposible, con ensayos de comportamiento. Sin embargo, es posible que mediante registros a nivel central sea posible lograr identificar algunos compuestos. Una desventaja de la identificación de compuestos activos mediante registros periféricos consiste en que se deben estudiar todos los tipos de NROs (dentro de distintos tipos de sénsulos) para descartar respuesta a un cierto compuesto o para conocer la totalidad de compuestos detectados.

Un método molecular, in vitro, elegante para identificar los ligandos a que se une un OR en particular consiste en remover el RO original de una NRO especifica (ahora convertida en una “neurona vacía”) y reemplazarlo con el RO, exógeno a estudiar (Dobritsa et al ., 2003; Hallem et al ., 2004). Al realizar registros electrofisiológicos de la “neurona vacía” con el RO exógeno adicionado, se puede no solo estudiar los ligandos a que se une el RO exógeno, sino también entender mejor el papel de las PEOs y PNSMs. Por otro lado, para estudiar los ligandos preferenciales de los ROs en las NROs, es común acoplar la preparación electrofisiológica a un cromatógrafo de gases (CG) donde, luego de inyectar un extracto natural de una mezcla de olor relevante en el cromatógrafo, los olores individuales alcanzan la preparación de uno en uno (Guerenstein & Guerin, 2001).

Los registros a nivel central son más sensibles debido a convergencia de información (ver la sub-sección: Nivel de SNC), y potencialmente también pueden permitir identificar olores individuales más fácilmente que en el caso de registros periféricos. Sin embargo, esta convergencia de información también da lugar a integración y procesamiento de la misma, lo cual puede resultar, por ejemplo, en neuronas que responden a mezclas de olores y no a olores individuales. Por otro lado, obviamente, estos registros permiten estudiar las bases del procesamiento de información olfativa y la generación de comportamiento olfativo.

Los métodos de registro a nivel central incluyen el registro intracelular, registro multicanal y registro de imágenes. En el registro intracelular el electrodo de registro, obtenido al estirar un capilar de vidrio con un sofisticado “estirador”, es insertado dentro de una neurona, con frecuencia a nivel del axón. Para lograr esto, el diámetro de la punta del electrodo debe ser menor a un micrómetro. La preparación debe estar constantemente bañada en una solución que simule la hemolinfa, mientras que el electrodo se llena con una solución salina, con frecuencia suplementada de un colorante (Christensen & Hildebrand, 1987; Guerenstein et al ., 2004). Luego de estudiar la fisiología de la neurona, es posible teñir la neurona en estudio inyectando el colorante dentro de ella. Esto permite correlacionar aspectos fisiológicos con morfológicos. Usualmente los amplificadores para registro intracelular vienen provistos de un sistema que ayuda a “impalar” (penetrar) la neurona y otro sistema para inyectar el colorante. Esta técnica permite un análisis detallado de neuronas individuales en estudio pero tiene como desventajas su dificultad técnica y la relativa inestabilidad de los registros. Cuando las neuronas a estudiar son muy pequeñas, lo más indicado es utilizar registros de “patch-clamp” en célula entera, lo cual, a diferencia del registro intracelular, permite con relativa facilidad registrar del soma neuronal (Sakmann & Neher, 1995).

El registro multicanal es un método de registro extracelular que, usando arreglos de multielectrodos de silicio, permite obtener señales eléctricas (p. ej., PAs) de muchas neuronas simultáneamente (Pawlowski et al ., 2005), con lo cual se puede comprender mejor como un olor es representado en una red de neuronas, por ejemplo, en el LA. Por ejemplo, en el LA de la polilla Manduca sexta es posible introducir al menos 16 canales de registro (Lei et al ., 2004). Una ventaja de este método es que, como es muy estable, permite registros por tiempos prolongados, lo cual hace posible experimentos en que se estudian cambios en la preparación, como por ejemplo, debido a aprendizaje o a manipulaciones farmacológicas.

Los métodos de estudio de imágenes ópticas miden la actividad neuronal usando luz. Esto se logra gracias a colorantes que cambian sus propiedades ópticas en función de alguna variable metabólica, como por ejemplo, la concentración de ciertos iones o moléculas, o un cambio en el potencial de membrana. Como en el caso de los registros de multicanal, una ventaja de estos métodos es la medición simultánea de la actividad neuronal en diferentes regiones, por ejemplo, del LA. De esta manera, se puede analizar el patrón combinatorio de glomérulos activados por un olor determinado. En estos métodos el colorante puede ser aplicado en la solución con que se baña a la preparación, puede ser introducido en grupos de neuronas (p. ej., NPs) o en neuronas individuales (incluso usando ingeniería genética). El colorante puede ser sensible, por ejemplo, a concentraciones de Ca +2o también a cambios del voltaje de membrana.

Conclusiones y perspectivas

Mucho se ha avanzado en los últimos 30 años en la comprensión de la morfología y función del sistema olfativo de los insectos. Los recientes progresos en el campo de la biología molecular están llevando a una comprensión detallada de los procesos de transporte de las moléculas de olor, de recepción a nivel de membrana y generación de impulsos nerviosos (traducción de señal). También se conoce actualmente cuales son los olores que activan muchos de los receptores de olor de varios insectos modelo. Por otro lado, se han comenzado a comprender muchos aspectos del procesamiento de información olfativa en el cerebro. Esto es de gran interés para comprender cómo un cerebro en miniatura procesa información compleja, lo cual tiene aplicación, por ejemplo, en robótica. También, esto conduce a entender las bases neuronales del comportamiento olfativo. Finalmente, el conocimiento adquirido tanto a nivel de sistema olfativo periférico como central, cada vez más, está contribuyendo al desarrollo de métodos de manipulación del comportamiento de insectos perjudiciales. Por ejemplo, el conocer cuales son los olores que un determinado sistema olfativo detecta, abre la posibilidad al desarrollo de olores simples atrayentes. Más aun, al conocer las conexiones neuronales en los circuitos del LA se pueden inferir combinaciones de olores que participan de una respuesta en particular, lo cual daría lugar a potentes efectos atrayentes, simulando estímulos naturales.

Agradecimientos

Fabio Guidobaldi agradece al Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET), Argentina, por su apoyo a través de una beca doctoral. Pablo Guerenstein agradece a CONICET, Universidad Nacional de Entre Ríos, Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica, y Fundación Bunge y Born, Argentina, por su apoyo financiero.

Referencias

ABUIN, L., BARGETON, B., ULBRICH, M. H., ISACOFF, E. Y., KELLENBERGER S., & BENTON, R. 2011. Functional architecture of olfactory ionotropic glutamate receptors. Neuron 69: 44–60.