HPLC optimal einsetzen

Neulinge bei mehrdimensionalen Trennungen sprechen oft davon, dass sie von der Anzahl der Variablen, die bei der Entwicklung einer 2D-Methode zu berücksichtigen sind, und der scheinbaren Komplexität von 2D-Trennungen überfordert sind. Es stimmt zwar, dass bei einer 2D-Methode mehr Variablen zu berücksichtigen sind als bei einer 1D-Methode, aber bei einer methodischen Herangehensweise ist es möglich, die Methodenentwicklung so anzugehen, dass man nicht überfordert wird. Im Folgenden betrachten wir die Methodenentwicklung von zwei verschiedenen Ausgangspunkten aus:

1 1. es existiert bereits eine 1D-Methode, die wir in die 1D-Trennung einer 2D-Methode umwandeln wollen,

2 2. die 2D-Methode muss von Grund auf entwickelt werden, wobei wir nicht durch die Parameter einer bestehenden 1D-Methode eingeschränkt sind.

Angenommen, wir wollen eine 2D-Methode entwickeln, indem wir eine 2D-Trennung zu einer bestehenden 1D-Methode hinzufügen. Dies ist in Fällen üblich, in denen eine 1D-Methode zur Trennung und Bestimmung der Konzentrationen mehrerer Verunreinigungen in einem Wirkstoff verwendet wird. Wenn diese Methode auf UV-Detektion beruht und plötzlich ein neuer Peak auftritt, lautet die erste Frage – was ist dieser neue Peak? Diese Frage lässt sich oft schnell mit einem einfachen Heartcut-Ansatz (LC-LC) und dem Hinzufügen einer 2D-Trennung lösen, die eine MS-Detektion erlaubt. Dies ermöglicht die Erfassung des neuen, unbekannten Peaks, dessen Übertragung auf die 2D-Säule, die Trennung der Bestandteile der Fraktion voneinander und von dem Puffer der 1D-mobilen Phase und schließlich die Elution und Detektion durch Massenspektrometrie. Die Entwicklung einer solchen Methode ist im Prinzip einfach, aber sobald man sich die Variablen ansieht, stößt man schnell auf ein Problem. Angenommen, die bestehende 1D-Methode läuft mit einer Flussrate von 1 ml/min und der zu bestimmende Peak ist 5 s breit auf halber Höhe. Wenn wir diesen Peak vollständig erfassen wollen, inklusive eines Sicherheitsabstands davor und danach, um leicht Retentionsverschiebungen von einer Analyse zur nächsten zu berücksichtigen, dann müssten wir einen etwa 20 s breiten Anteil des 1D-Eluats sammeln (8σ Peakbreite, plus 10% auf jeder Seite). Bei einer Flussrate von 1000 μl/min entspricht dies einem Fraktionsvolumen von etwa 333 μl. Als Injektionsvolumen für die 2D-Trennung ist diese Menge selbst für die größten heute gebräuchlichen analytischen Säulen (z. B. 150 mm × 4,6 mm Innendurchmesser) zu groß und wird die Qualität der 2D-Trennung erheblich beeinträchtigen. Dies ist der erste Punkt, an dem eine wichtige Entscheidung getroffen werden muss. Wir haben drei Hauptoptionen (Leser, die sich für nähere Einzelheiten interessieren, werden auf die neuere Literatur verwiesen; siehe [15]):

1 1. Injizieren Sie die gesamte Fraktion, wie sie ist, in eine große 2D-Säule und hoffen Sie auf das Beste. Dies funktioniert gut in Fällen, in denen der Zielanalyt aus der 1D-Säule in einem Eluat enthalten ist, welches ein schwaches Lösungsmittel für die 2D-Säule darstellt (z. B. 1D-Eluat mit 10/90 ACN/Wasser, der in eine mobile 2D-Phase mit 20/80 ACN/Wasser injiziert wird), aber dies ist nicht immer möglich oder praktikabel.

2 2. Injizieren Sie einen kleineren Anteil des 1D-Peaks, um das Fraktionsvolumen handhabbarer zu machen (z. B. 40 μl). Dieser Ansatz löst das Problem des Injektionsvolumens, führt aber möglicherweise zu neuen Problemen:a) es besteht die Gefahr, dass Analyten fehlen, die im vorderen oder hinteren Teil des 1D-Zielpeaks eluieren, undb) die Reproduzierbarkeit dieses Ansatzes ist nicht gut, da er empfindlich auf kleine Verschiebungen der 1D-Retentionszeit reagiert.

3 3. Die Option, die dem Analytiker die größte Kontrolle bietet, ist die Verwendung einer aktiven Modulationstechnik, um die Auswirkungen des großen Fraktionsvolumens auf die 2D-Trennung zu steuern. Die gängigsten Ansätze sind:• Verdünnung des 1D-Eluats mit schwachem Lösungsmittel unter Verwendung einer zusätzlichen Pumpe (z. B. Verdünnung mit Wasser im Falle einer RP-Trennung in der zweiten Dimension)• Aktive Lösungsmittelmodulation unter Verwendung eines Ventils zur Anpassung der 1D-Fraktion• Verwendung einer „Adsorptionsfalle“ zur Trennung der interessierenden Analyten von der 1D-Matrix vor der Injektion in die 2D-Säule.

Nachdem das geeignete Volumen der 1D-Fraktion und der Ansatz zur Übertragung dieser Fraktion in die zweite Dimension gewählt ist, können die Dimensionen und Bedingungen für die 2D-Säule festgelegt werden. Im Falle einer LC-LC- Trennung wie der in diesem Szenario beschriebenen, hat der Analytiker in der zweiten Dimension eine große Flexibilität, und die meisten Regeln, die wir für die Auswahl der Säulen und Bedingungen in 1D-LC verwenden, gelten auch hier. Die Säulenlänge, die Partikelgröße und die Flussrate werden stark von der Analysezeit für die 2D-Trennung bestimmt, und die theoretischen Überlegungen hinter dieser Auswahl sind einfach anzuwenden [27]. Trennungen in der zweiten Dimension, die lang dauern und eine hohe Auflösung erfordern, profitieren von langen Säulen (> 100 mm). Andererseits werden kurze Trennungen oder in Fällen, in denen nur eine grobe 2D-Trennung erforderlich ist (z. B. bei Entsalzungsanwendungen), kurze Säulen (< 100 mm) ausreichen. Bei Verwendung der UV-Detektion in der zweiten Dimension sind Säulen mit größerem Durchmesser (> 3, 0 mm i. d.) und höheren Durchflussraten (> 1ml/min) wünschenswert, da diese Bedingungen die Auswirkungen des großen Volumens des injizierten 1D-Eluats mildern. Andererseits sind bei der MS-Detektion in der zweiten Dimension Säulen mit kleinerem Durchmesser (< 2,1 mm i. d.) und niedrigeren Flussraten (< 1ml/min) wünschenswert, um das „Fluten“ des MS-Einlasses mit Lösungsmittel zu vermeiden.

Wenn wir eine 2D-LC-Methode von Grund auf neu entwickeln, haben wir nicht so viele Einschränkungen zu beachten wie beim Hinzufügen einer 2D-Trennung zu einer bestehenden 1D-LC-Trennung. In den meisten Fällen nutzen die Anwender diese Freiheit, indem sie die Durchflussrate der 1D-Trennung reduzieren, sodass das Volumen des 1D-Eluats, welches in die 2D-Säule geleitet wird, nicht so groß ist wie im oben beschriebenen Szenario. Dies ist besonders hilfreich bei LC × LC-Trennungen, bei denen 2D-Säulen tendenziell klein sind, um schnelle 2D-Trennungen zu ermöglichen. In diesem Fall beträgt eine typische 1D-Durchflussrate 50 μl/min. Aber selbst bei LC-LC- und hybriden 2D-LC-Trennungen ist der Umgang mit einer 1D-Flussrate von 200 μl/min wesentlich einfacher als der Umgang mit 1000 μl/min.

Wie in Abb. 1.2 dargestellt, werden bei umfassenden 2D-LC-Trennungen viele Fraktionen des 1D-Eluats gesammelt und im Verlauf einer einzigen 2D-LC-Analyse in die 2D-Säule überführt. Dies bedeutet, dass alle mit einer einzigen 2D-Trennung verbundenen Schritte im Verlauf einer LC × LC-Analyse zehn- oder hundertmal stattfinden, einschließlich eines oder zweier Ventilschaltungen je Fraktion, in der Regel einhergehend mit einer veränderten Zusammensetzung der mobilen Phase für die Elution der injizierten Komponenten. Die meisten LC × LC-Trennungen dauern zwischen 30 min bis 3 h, wobei die Zeitskala jeder 2D-Trennung normalerweise 15–120 s beträgt. Dies wiederum erfordert, dass die zweite Dimension mit kurzen (< 50 mm), schmalen (2,1 mm i. d.) Säulen und hohen (> l ml/min) Flussraten betriebenwird. Natürlich gibt es Ausnahmen, aber diese Bedingungen sind typisch. In unserer Arbeit haben wir beobachtet, dass die Konstruktion des Ventils, das für den Transfer von 1D-Eluatfraktionen in die zweite Dimension verwendet wird, und der Druck, bei dem die 2D-Säule betrieben wird, einen signifikanten Einfluss auf die Lebensdauer von 2D-Säulen haben, weshalb diese Parameter bei der Entwicklung von LC × LC-Methoden unbedingt in Betracht gezogen werden sollten [23, 28].