HPLC optimal einsetzen

Dabei war es wichtig, beides zu berücksichtigen: unterschiedliche Herausforderungen chromatografischer Natur, aber auch unterschiedliche Rahmenbedingungen im Alltag. Erst dies ermöglicht einen differenzierten Blickwinkel und folglich eine zielgerechte Vorgehensweise. Die Autoren kommen daher aus der Forschung, sind Dienstleister in Industrieunternehmen oder privaten Laboren, haben selbst Tools entwickelt oder sind Mitarbeiter von bekannten Herstellern.

Die Leser:innen mögen im Buch Anregungen finden, um ihre Optimierungsstrategie zu entwickeln.

Mein Dank gilt meinen Autorenkolleg:innen für ihre Zeit und ihr Engagement sowie Wiley-VCH, der die Realisierung dieses Vorhabens ermöglicht hat.

Blieskastel, im November 2021

Stavros Kromidas

Das Buch besteht aus vier Teilen:

Teil I: Optimierungsstrategien für einzelne Fragestellungen

Im ersten Teil werden Optimierungsstrategien für unterschiedliche Analyte besprochen, von Kleinmolekülen und chiralen Substanzen bis hin zu Biomolekülen. Auch unterschiedliche Betriebsarten werden behandelt: LC-MS, 2D-HPLC, HILIC, SFC. Schließlich werden Optimierungsstrategien basierend auf Strukturinfos der Analyte vorgestellt, es wird ferner auf Optimierungsmöglichkeiten im regulierten Umfeld eingegangen.

Teil II: Computergestützte Strategien (in-silico-Anwendungen)

In Teil II werden anhand konkreter Fragestellungen Konzepte für die computergestützte Methodenentwicklung für Kleinmoleküle und Biomoleküle vorgestellt.

Teil III: Anwender berichten

Dienstleister aus zwei Industrieunternehmen und zwei Privatlaboren stellen in Teil III anhand der Vorgaben und Wünsche von internen und/oder externen Kunden ihre Konzepte zur Methodenentwicklung vor.

Teil IV: Hersteller berichten

Mitarbeiter von fünf bekannten HPLC-Herstellern zeigen, wie durch die Konzeption von HPLC-Geräten, durch unterschiedliche Tools sowie die dahinterstehende Philosophie HPLC-Anwender:innen unterstützt werden, eine möglichst effiziente, der Fragestellung angepasste HPLC-Methode zu etablieren.

Das Buch ist als Leitfaden konzipiert und muss nicht linear gelesen werden. Die einzelnen Kapitel stellen abgeschlossene Module dar, ein „Springen“ ist jederzeit möglich. Damit haben wir versucht, dem Charakter des Buches als Nachschlagewerk gerecht zu werden. Die Leser:innen mögen davon profitieren.

Dwight R. Stoll 1

1 Gustavus Adolphus College, St. Peter, USA

In der Vergangenheit war ein Großteil der Forschung, die sich mit mehrdimensionalen Trennungen und ihrer Anwendung auf reale analytische Probleme befasst hat, auf den Umgang mit komplexen Proben ausgerichtet. Diese werden traditionell als Proben mit Hunderten oder Tausenden von Substanzen beschrieben und stammen oft aus natürlichen Quellen wie Pflanzenextrakten oder Körperflüssigkeiten (z. B. Blut oder Urin). Es hat sich jedoch gezeigt, dass die mehrdimensionale Trennung auch für Proben, die schwer zu trennende, aber – nach der traditionellen Definition – nicht komplexe Analyten enthalten, äußerst effektiv sein kann. Da diese Unterscheidung einen großen Einfluss darauf haben kann, wie man an die Methodenentwicklung herangeht, beginnen wir hier mit einer Gegenüberstellung der beiden Fälle.

Die Schwierigkeit, die mit der Trennung einer bestimmten Probe verbunden ist, kann von ihrer schieren Komplexität (d. h. Tausende von darin enthaltenden Substanzen) herrühren. In diesem Fall reicht es nicht aus, sich auf die chromatographische Trennung allein zu verlassen, um das Gemisch vollständig zu trennen, sondern es ist ein zusätzliches Momentum für Selektivität erforderlich (z. B. Probenvorbereitung und/oder selektive Detektion mittels Massenspektrometrie). Es kommt jedoch häufig vor, dass Proben, die nur wenige Substanzen enthalten, aufgrund des ho-hen Ähnlichkeitsgrades der Substanzen in der Mischung schwer zu trennen sind. So kann ein Gemisch beispielsweise nur sechs Substanzen enthalten, aber wenn zwei dieser sechs Substanzen Enantiomere sind (1a und 1b), dann kann die vollständige Trennung des Gemisches mit einer einzigen Säule schwierig sein, selbst wenn die Trennung der Substanzen 2–5 von 1a/1b einfach ist. Solche Situationen treten heute häufiger auf als früher, zum Teil aufgrund der Entwicklung niedermolekularer Wirkstoffe mit mehreren chiralen Zentren [1] und der zunehmenden Bedeutung des Nachweises sowohl der D- als auch der L-Enantiomere von Aminosäuren ([2], siehe dazu auch Kap. 6und 7).

Wie oben erwähnt, wird traditionell davon ausgegangen, dass komplexe Proben Hunderte oder Tausende von unterschiedlichen Substanzen enthalten. Diese Proben stammen oft, aber nicht immer, aus der Natur. So können beispielsweise chemisch synthetisierte Tenside und Polymere zu sehr heterogenen Mischungen aus Tausenden von verschiedenen Substanzen führen. In der Vergangenheit konzentrierte sich die Analyse solcher Proben durch mehrdimensionale Chromatographie hauptsächlich auf sogenannte umfassende Trennmethoden, die eine Art globales Profil oder „Fingerprint“ der Probe liefern. In solchen Fällen, in denen nur ein einziges oder wenige Moleküle in der Probe für die Analyse von Bedeutung sind, können einfachere mehrdimensionale Trennmethoden wie z. B. das Schneiden eines Peaks ausreichend sein, ja sogar bevorzugt werden.

Wie in der Literatur zur mehrdimensionalen Trennung und weiter unten oft diskutiert wird, ist der Prozess der Entwicklung einer mehrdimensionalen Trennmethode ein kompromissbehaftetes Verfahren. Beispielsweise beinträchtigen Bedingungen, die kürzere Analysezeiten begünstigen, die Nachweisempfindlichkeit und umgekehrt. Daher ist es für den Analytiker wichtig, gleich zu Beginn der Methodenentwicklung zu erkennen und zu definieren, welche Leistungsmerkmale der Methode für ihn am wichtigsten sind. Wenn zum Beispiel das Erreichen einer vollständigen Auflösung von sechs kritischen Analytenpaaren für die Anwendung der Methode von entscheidender Bedeutung ist, dann sollten Entscheidungen zur Methodenentwicklung dieses Ziel unterstützen, auch wenn dies auf Kosten der Analysezeit und/oder der Nachweisempfindlichkeit geht.

Alle zweidimensionalen Trennungen können entweder „offline“ oder „online“ durchgeführt werden. Im Offline-Modus werden eine oder mehrere Fraktionen des 1D-Eluats in einem Zwischenspeicher, wie z. B. einem Satz von Vials oder einer Mikrotiterplatte, gesammelt. Diese Fraktionen werden dann zu einem späteren Zeitpunkt (Minuten bis Jahre) in ein anderes LC-System (entweder dasselbe LC-System, das unter anderen Bedingungen als für die 1D-Trennung betrieben wird, oder ein ganz anderes LC-System) injiziert, entweder mit oder ohne Zwischenverarbeitung dieser Fraktionen. Bei Proteomik-Anwendungen der 2D-LC ist es beispielsweise üblich, die Fraktionen vor der Analyse durch die 2D-Trennung zu entsalzen oder durch Verdunstung zu trocknen, um organisches Lösungsmittel zu entfernen [3]. Im Online-Modus werden die von der 1D-Säule gesammelten Fraktionen entweder sofort durch direkte Injektion in die 2D-Säule weiterverarbeitet oder für eine kurze Zeit (Sekunden bis Stunden) im Gerät selbst gespeichert (normalerweise in Kapillarschleifen oder an der Oberfläche von Sorbentien „Sorbensfallen“). Ein Beispiel für eine Instrumentenkonfiguration, die üblicherweise für diesen Zweck verwendet wird, ist in Abb. 1.1 dargestellt. In diesem Fall hat das Schnittstellenventil zwischen der 1D- und der 2D-Säule zwei Positionen. Durch Umschalten zwischen den beiden Stellungen ändert sich die Rolle der Schleifen 1 und 2 zwischen dem Sammeln des 1D-Eluats und dem Einleiten des 1D-Eluats in den 2D-Zustrom, wodurch dann das Eluat in die 2D-Säule injiziert wird.