HPLC optimal einsetzen

1 Cover

2 Titelseite Herausgegeben von Stavros Kromidas

3 Impressum Herausgegeben von Stavros Kromidas Consultant Breslauer Str. 3 66440 Blieskastel Deutschland Alle Bücher von WILEY-VCH werden sorgfältig erarbeitet. Dennoch übernehmen Autoren, Herausgeber und Verlag in keinem Fall, einschließlich des vorliegenden Werkes, für die Richtigkeitvon Angaben, Hinweisen und Ratschlägen sowie für eventuelle Druckfehler irgendeine Haftung. Bibliografische Information der Deutschen Nationalbibliothek Die Deutsche Nationalbibliothek verzeichnet diese Publikation in der Deutschen Nationalbibliografie; detaillierte bibliografische Daten sind im Internet über http://dnb.d-nb.deabrufbar . © 2022 WILEY-VCH GmbH, Boschstr. 12, 69469 Weinheim, Germany Alle Rechte, insbesondere die der Übersetzung in andere Sprachen, vorbehalten. Kein Teil dieses Buches darf ohne schriftliche Genehmigung des Verlages in irgendeiner Form – durch Photokopie, Mikroverfilmung oder irgendein anderes Verfahren – reproduziert oder in eine von Maschinen, insbesondere von Datenverarbeitungsmaschinen, verwendbare Sprache übertragen oder übersetzt werden. Die Wiedergabe von Warenbezeichnungen, Handelsnamen oder sonstigen Kennzeichen in diesem Buch berechtigt nicht zu der Annahme, dass diese von jedermann frei benutzt werden dürfen. Vielmehr kann es sich auch dann um eingetragene Warenzeichen oder sonstige gesetzlich geschützte Kennzeichen handeln, wenn sie nicht eigens als solche markiert sind. Print ISBN 978-3-527-34788-9 ePDF ISBN 978-3-527-82853-1 ePub ISBN 978-3-527-82852-4 Satz le-tex publishing services GmbH, Leipzig Gedruckt auf säurefreiem Papier. 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1

4 Vorwort

5 Zum Aufbau des Buches

6 Teil I: Optimierungsstrategien für einzelne Fragestellungen 1 2D-HPLC – Methodenentwicklung für erfolgreiche Trennungen 1.1 Motivationen für zweidimensionale Trennung 1.1 Motivationen für zweidimensionale Trennung In der Vergangenheit war ein Großteil der Forschung, die sich mit mehrdimensionalen Trennungen und ihrer Anwendung auf reale analytische Probleme befasst hat, auf den Umgang mit komplexen Proben ausgerichtet. Diese werden traditionell als Proben mit Hunderten oder Tausenden von Substanzen beschrieben und stammen oft aus natürlichen Quellen wie Pflanzenextrakten oder Körperflüssigkeiten (z. B. Blut oder Urin). Es hat sich jedoch gezeigt, dass die mehrdimensionale Trennung auch für Proben, die schwer zu trennende, aber – nach der traditionellen Definition – nicht komplexe Analyten enthalten, äußerst effektiv sein kann. Da diese Unterscheidung einen großen Einfluss darauf haben kann, wie man an die Methodenentwicklung herangeht, beginnen wir hier mit einer Gegenüberstellung der beiden Fälle. 1.2 Auswahl des zweidimensionalen Trennungsmodus 1.2 Auswahl des zweidimensionalen Trennungsmodus Alle zweidimensionalen Trennungen können entweder „offline“ oder „online“ durchgeführt werden. Im Offline-Modus werden eine oder mehrere Fraktionen des 1D-Eluats in einem Zwischenspeicher, wie z. B. einem Satz von Vials oder einer Mikrotiterplatte, gesammelt. Diese Fraktionen werden dann zu einem späteren Zeitpunkt (Minuten bis Jahre) in ein anderes LC-System (entweder dasselbe LC-System, das unter anderen Bedingungen als für die 1D-Trennung betrieben wird, oder ein ganz anderes LC-System) injiziert, entweder mit oder ohne Zwischenverarbeitung dieser Fraktionen. Bei Proteomik-Anwendungen der 2D-LC ist es beispielsweise üblich, die Fraktionen vor der Analyse durch die 2D-Trennung zu entsalzen oder durch Verdunstung zu trocknen, um organisches Lösungsmittel zu entfernen [3]. Im Online-Modus werden die von der 1D-Säule gesammelten Fraktionen entweder sofort durch direkte Injektion in die 2D-Säule weiterverarbeitet oder für eine kurze Zeit (Sekunden bis Stunden) im Gerät selbst gespeichert (normalerweise in Kapillarschleifen oder an der Oberfläche von Sorbentien „Sorbensfallen“). Ein Beispiel für eine Instrumentenkonfiguration, die üblicherweise für diesen Zweck verwendet wird, ist in Abb. 1.1 dargestellt. In diesem Fall hat das Schnittstellenventil zwischen der 1D- und der 2D-Säule zwei Positionen. Durch Umschalten zwischen den beiden Stellungen ändert sich die Rolle der Schleifen 1 und 2 zwischen dem Sammeln des 1D-Eluats und dem Einleiten des 1D-Eluats in den 2D-Zustrom, wodurch dann das Eluat in die 2D-Säule injiziert wird. Abb. 1.1 Instrumentenkonfiguration, die typischerweise für 2D-LC verwendet wird (Quelle: Dr. Gabriel Leme). Da kommerziell erhältliche Geräte für die 2D-LC-Trennung immer ausgefeilter und zuverlässiger geworden sind, geht der Trend in der Industrie weg von der Offline-Trennung, da die Durchführung von Offline-Trennungen für eine große Anzahl von Proben unpraktisch ist und das Risiko der Degradation und Kontamination der 1D-Fraktionen besteht, wenn sie außerhalb des Geräts gehandhabt werden müssen [4]. Angesichts dieses Trends habe ich mich für den Rest dieses Kapitels ganz auf die Online-2D-LC konzentriert. Leser, die mehr über Offline-2D-LC erfahren möchten, werden auf Übersichtsartikel verwiesen, die sich diesem Thema widmen [5, 6]. 1.3 Wahl der Trennmodi 1.3 Wahl der Trennmodi Nachdem man sich für den Modus der 2D-Trennung entschieden hat, besteht die nächste wichtige Entscheidung darin, welche zwei Trennmodi in der ersten und zweiten Dimension des 2D-Systems verwendet werden. 1.4 Auswahl der Trennungsbedingungen 1.4 Auswahl der Trennungsbedingungen Neulinge bei mehrdimensionalen Trennungen sprechen oft davon, dass sie von der Anzahl der Variablen, die bei der Entwicklung einer 2D-Methode zu berücksichtigen sind, und der scheinbaren Komplexität von 2D-Trennungen überfordert sind. Es stimmt zwar, dass bei einer 2D-Methode mehr Variablen zu berücksichtigen sind als bei einer 1D-Methode, aber bei einer methodischen Herangehensweise ist es möglich, die Methodenentwicklung so anzugehen, dass man nicht überfordert wird. Im Folgenden betrachten wir die Methodenentwicklung von zwei verschiedenen Ausgangspunkten aus: 1 1. es existiert bereits eine 1D-Methode, die wir in die 1D-Trennung einer 2D-Methode umwandeln wollen, 2 2. die 2D-Methode muss von Grund auf entwickelt werden, wobei wir nicht durch die Parameter einer bestehenden 1D-Methode eingeschränkt sind. 1.5 Beispiele für die Methodenentwicklung 1.5 Beispiele für die Methodenentwicklung Im Rahmen dieses Beitrags ist es nicht möglich, alle Aspekte der Methodenentwicklung im Detail zu behandeln. Ich denke, die nächstbeste Möglichkeit ist es, einige Beispiele von 2D-LC-Methoden vorzustellen und die wichtigsten Entscheidungen bei deren Methodenentwicklung zu erklären. Dies soll den Lesern ermöglichen, eine ähnliche Vorgehensweise bei der Entwicklung ihrer eigenen Methoden anzuwenden. 1.6 Ausblick Literatur 2 Do you HILIC? Mit Massenspektrometrie? Dann bitte systematisch 2.1 Ausgangssituation und optimale Nutzung von stationären HILIC-Phasen 2.2 Ausgangssituation und optimale Nutzung von mobiler HILIC-Phase 2.3 Weitere Einstellungen bzw. Bedingungen speziell für massenspektrometrische Detektion (siehe auch Kap. 3) Literatur 3 Optimierungsstrategien in der LC-MS-Methodenentwicklung 3.1 Einführung 3.2 Methodenneuentwicklung für HPLC-MS-Trennungen 3.3 Übertragen von HPLC-Bestandsmethoden an die Massenspektrometrie 3.4 Abkürzungen Literatur 4 Strategien für die erfolgreiche Charakterisierung von Proteinbiopharmazeutika 4.1 Einführung in Proteinbiopharmazeutika 4.2 Von der Standard- zur Hochleistungschromatographie von Proteinbiopharmazeutika 4.3 Online-Kopplung von nicht denaturierenden LC-Modi mit MS 4.4 Mehrdimensionale LC-Ansätze für Proteinbiopharmazeutika 4.5 Schlussfolgerung und Zukunftstrends in der Analyse von Proteinbiopharmazeutika Literatur 5 Optimierungsstrategien für die HPLC-Trennung von Biomolekülen 5.1 Einleitung 5.2 Optimierung der chromatographischen Trennung 5.3 Optimierung der Geschwindigkeit einer HPLC-Trennung 5.4 Optimierung der Sensitivität einer HPLC-Trennung 5.5 Multidimensionale Trennungen (siehe auch Kap. 1) 5.6 Überlegungen bezüglich MS-Detektion (siehe auch Kap. 3) 5.7 Schlussfolgerungen und Ausblick Literatur 6 Optimierungsstrategien in der Supercritical Fluid Chromatography (SFC) mit gepackten Säulen 6.1 Auswahl einer stationären Phase, die eine angemessene Retention