HPLC optimal einsetzen

24Davis, J.M., Stoll, D.R. und Carr, P.W. (2008). Dependence of effective peak capacity in comprehensive two-dimensional separations on the distribution of peak capacity between the two dimensions. Analytical Chemistry 80 (21): 8122–8134, https://doi.org/10.1021/ac800933z.

25Pirok, B.W.J., Stoll, D.R. und Schoenmakers, P.J. (2019). Recent developments in two-dimensional liquid chromatography – Fundamental improvements for practical applications. Analytical Chemistry 91 (1): 240–263, https://doi.org/10.1021/acs.analchem.8b04841.

26Stoll, D.R., Shoykhet, K., Petersson, P. und Buckenmaier, S. (2017). Active solvent modulation – A valve-based approach to improve separation compatibility in two-dimensional liquid chromatography. Analytical Chemistry 89 (17): 9260–9267, https://doi.org/10.1021/acs.analchem.7b02046.

27Carr, P.W., Wang, X. und Stoll, D.R. (2009). Effect of pressure, particle size, and time on optimizing performance in liquid chromatography. Analytical Chemistry 81 (13): 5342–5353, https://doi.org/10.1021/ac9001244.

28Talus, E.S., Witt, K.E. und Stoll, D.R. (2015). Effect of pressure pulses at the interface valve on the stability of second dimension columns in online comprehensive two-dimensional liquid chromatography. Journal of Chromatography A 1378: 50–57, https://doi.org/10.1016/j.chroma.2014.12.019.

29Koshel, B., Birdsall, R. und Chen, W. (2020). Two-dimensional liquid chromatography coupled to mass spectrometry for impurity analysis of dye-conjugated oligonucleotides. Journal of Chromatography B 1137: 121906, https://doi.org/10.1016/jjchromb.2019.121906.

30Vanhoenacker, G., Steenbeke, M., Sandra, K. und Sandra, P. (2018). Profiling nonionic surfactants applied in pharmaceutical formulations by using comprehensive two-dimensional LC with ELSD and MS detection. LCGC North America 36 (6): 385–393.

31Stoll, D.R., Cohen, J. und Carr, P. (2006). Fast, comprehensive online two-dimensional high performance liquid chromatography through the use of high temperature ultra-fast gradient elution reversed-phase liquid chromatography. Journal of Chromatography A 1122 (1–2): 123–137, https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.04.058.

32Guiochon, G., Gonnord, M.F., Zakaria, M., Beaver, L.A. und Siouffi, A.M. (1983). Chromatography with a two-dimensional column. Chromatographia 17 (3): 121–124, https://doi.org/10.1007/BF02271033.

33Davydova, E., Schoenmakers, P.J. und Vivó-Truyols, G. (2013). Study on the performance of different types of threedimensional chromatographic systems. Journal of Chromatography A 1271 (1): 137–143, https://doi.org/10.1016/j.chroma.2012.11.043.

1 1) http://www.multidlc.org/literature/2DLC-Applications.

2 2) www.multidlc.org/megatable.

Thomas Letzel 1

1 Analytisches Forschungsinstitut für Non-Target Screening GmbH, Augsburg, Deutschland

Die „hydrophile Interaktionsflüssigchromatographie“ (d. h. HILIC für „Hydrophilie Interaction Liquid Chromatography“) wurde erstmals im Jahre 1990 von Andrew Alpert [1] namentlich so erwähnt. Seither gab es ein regelmäßiges Auf und Ab in der Nutzung dieser Technik; beispielsweise nimmt nun nach Jahren der Stagnation seit einiger Zeit der Einsatz von HILIC wieder sehr stark zu.

Letztlich resultierten die „Downs in der Nutzung von HILIC“ aus einem manchmal missverstandenen Retentionsmechanismus beziehungsweise der oftmals nicht systematischen Vorgehensweise in der Methodenoptimierung. In diesem Kapitel wird versucht, eine mögliche Systematik zur Methodenoptimierung zu skizieren. Denn gerade für (sehr) polare Moleküle, d. h. in erster Linie Moleküle mit negativem log D -(log P )-Wert und somit auch per Definition (sehr) gut wasserlöslichen Molekülen, drängt sich eine Trennung mit der HILIC geradezu auf.

Zur besseren Einordnung und Diskussion der oft verwendeten log D -Werte von Analyten und der entsprechenden Nutzung passender Techniken in der Trennung von Molekülen zeigt Abb. 2.1 ein (nicht vollständiges) Bild mit der klassischen RPLC, der polaritätserweiterten RPLC, der HILIC und der IC. Damit wird direkt ersichtlich, dass Moleküle im physikochemischen Übergang von „besser oktanollöslich“ zu „besser wasser-löslich“ (d. h. im log D -Wertebereich um 0) sowie „geladene“ und „ungeladene“ Moleküle mit mehreren Techniken getrennt werden können. Weitere Trenntechniken wie CE, GC und SFC werden dabei nicht berücksichtigt (u. a. da diese auch unterschiedliche Gerätetechnologie benötigen würden), gibt es aber auch noch.

Betrachtet man sich nun also zunächst die zu trennenden Substanzen bzw. deren Polarität bzw. deren log D -Wert bzw. deren p K s-Wert, so gibt es oft starke Gründe, diese mit der HILIC zu retardieren bzw. zu trennen, beispielsweise dann, wenn der log D -Wert im (sehr) negativen Bereich liegt und ein geladenes Molekül vorliegt. Abbildung 2.2 zeigt mit Toluol (und seinem log P -Wert von 2,5) und 4-Hydroxybenzoesäure (und einem log D (pH 7)-Wert von –1,24 und einem gleichzeitigen p K s-Wert von 4,54) ein prominentes Beispiel zum Vergleich in der Trennung mit RPLC und mit HILIC [2]. Das unpolare Molekül Toluol wird bei einem pH-Wert von 7,0 also grundsätzlich besser auf einer RPLC-Säule retardiert und das polare Molekül 4-Hydroxybenzoesäure auf einer HILIC-Säule.

Abb. 2.1Schema der Polaritätsbereiche von Trenntechniken. Reversed-Phase-Flüssig- chromatographie (RPLC) ist einsetzbar zur Trennung von polaren und nichtpolaren löslichen Analyten. Polar modifizierte RPLC ermöglicht die erweiterte Trennung tiefer in den polareren Bereich. Zur Trennung von sehr polaren Molekülen kommt typischerweise die hydrophile Interaktionsflüssigchromatographie (HILIC) zum Einsatz sowie die Ionenchro- matographie für geladene Analyten.

4-Hydroxybenzoesäure kann beispielsweise dem pH-Wert der mobilen Phase entsprechend einen bei pH 3 log D -Wert von 1,31, bei pH 7 von –1,24 oder bei pH 12 von –4,14 besitzen (berechnet mit dem log D Predictor [3]) und hat einen p K s1-Wert von 4,54 [4]. Somit ist es entscheidend, unter welchen pH-Wert-Bedingungen man die mobile Phase in der HILIC betreibt (siehe Abschn. 2.2, c) pH-Wert), denn die beeinflussen somit die Polarität und den Ladungszustand eines zu trennenden Moleküls direkt. In diesem Fall könnte man zur Analytik des Moleküls bei einem pH-Wert 3 auf die RPLC zurückgreifen, bei höheren pH-Werten ist HILIC empfehlenswert. Es ist also auch naheliegend, dass der pH-Wert für den entsprechenden Ladungszustand der Moleküle stabil gehalten werden muss oder wie – in dem Buchkapitel zur „Gradientenelution in HILIC“ beschrieben [5] – bewusst zur Ladungsänderung von Molekülen in pH-Gradienten genutzt werden kann.

In dem hier vorliegenden Buchkapitel beschreibe ich den derzeitigen Stand des Wissens um den Trennmechanismus von Molekülen unter Berücksichtigung der Wasserschicht auf der Partikeloberfläche (und somit dem Verteilungsgleichgewicht der Moleküle zwischen mobiler Phase und der wässrigen Phase an der Oberfläche) und den Adsorptionseigenschaften der stationären Phase sowie den eventuell vorhandenen elektrostatischen Wechselwirkungsstellen der stationären Phase nicht. Anstatt dessen sei an dieser Stelle hierzu auf eigene frühere Arbeiten [2, 6] oder aber auch auf die exzellenten Arbeiten von Kolleg:innen [7–9] verwiesen. Auch wenn hier darauf verzichtet wird, die Kenntnis der mechanistischen Grundlagen ist wesentlich, um eine Methodenentwicklung systematisch durchführen zu können. Nehmen Sie sich also die Zeit, sich dieses Wissen anzueignen.