HPLC optimal einsetzen

Abb. 2.2Toluol und 4-Hydroxybenzoesäure als prominentes Beispiel [2] zum Vergleich in der Trennung mittels RPLC und mittels HILIC.

Kommt HILIC nun aufgrund der passenden Polarität der zu trennenden Substanzen als Trenntechnik in die engere Auswahl, fällt die Entscheidung letztlich darauf, diese zu nutzen – und haben Sie sich (in der weiterführenden Literatur) mit dem Trennmechanismus vertraut gemacht? Falls ja, dann steht einer erfolgreichen Umsetzung nichts mehr im Wege.

In diesem Kapitel liegt der Schwerpunkt gleichzeitig auf massenspektrometrischer Kompatibilität der HILIC-Bedingungen, was eine Methodenoptimierung letztlich aber auch ein bisschen vereinfacht (da einige Parameter durch die massenspektrometrische Detektion vorgegeben sind; siehe Abschn. 2.3).

Um eine erfolgreiche Optimierung sicherzustellen, sollte die Durchführung der Schritte bzw. Parameter immer in der folgenden Reihenfolge durchgeführt werden:

1 I. Stationäre Phase

2 II. Mobile Phase mita) Organischem Laufmittelb) Salzenc) pH-Wert

3 III. Weitere Einstellungen bzw. Bedingungen speziell für massenspektrometrische Detektion

Die Vielfalt der auf dem Markt befindlichen stationären HILIC-Phasen nimmt seit Jahren stetig zu, sodass es mittlerweile eine große Auswahl an (auch speziell für die HILIC entwickelte) Materialien gibt. Allerdings ist es für den Anwender ohne weitere Kenntnis der Eigenschaften seiner zu trennenden Substanzen (siehe dazu noch mal den vorherigen einführenden Abschnitt von Kapitel 2) nicht einfach, die passende Auswahl für die jeweilige Phase zu treffen. Letzten Endes entscheiden die Eigenschaften der Analyten nämlich darüber, ob man geladene oder nicht geladene stationäre Phasen nutzen sollte. Bevor wir uns allerdings mit den funktionellen Oberflächen der HILIC-Säulen im Detail beschäftigen, zuerst noch eine grundsätzliche Definition von HILIC-stationären Phasen. So besagt zum Beispiel unsere Definition von stationären HILIC-Phasen, dass typische HILIC-Phasen mit ihrem „hydrophilen Charakter Wasser auf der Oberfläche anreichern können sollten“ [2]. Zunächst einmal sind hierfür nicht alle Phasen gleichermaßen gut geeignet. Dabei beeinflusst zuallererst u. a. die unterschiedliche Hydrophilie der Materialien die Stärke der Wasserschicht, in die die Analyten aus der mobilen Phase durch sogenannte Verteilung übergehen können. Das hat selbstverständlich einen direkten Einfluss auf die Retention dieser Analyten. So ermöglicht die Anwesenheit geladener und/oder polarer funktioneller Gruppen auf der Materialoberfläche eine weitere Stabilisierung der Wasserschicht am Partikel. Auf der anderen Seite haben diese funktionellen Gruppen auch direkte Interaktionen mit entsprechenden Analyten, wie elektrostatische Wechselwirkungen und/oder Wasserstoffbrückenbindungen. Somit ist es von großer Wichtigkeit, die stationäre Phase auf Basis der chemischen Eigenschaften der zu untersuchenden Analyten zu wählen.

HILIC-Phasen basieren meist auf klassischen Silikapartikeln, neuerdings auch mit Polymeroberflächen. Dabei können bei Ersteren prinzipiell zwei Gruppen unterschieden werden (die im Folgenden behandelt werden): Silikapartikel mit daran chemisch gebundenen polaren funktionellen Gruppen und Silikapartikel mit unverändert freiliegenden Silanolgruppen. Ein prinzipielles Schema dieser Klassifizierung ist der Abb. 2.3 zu entnehmen.

Die ersten Anwendungen wurden ursprünglich überwiegend mit unmodifiziert vorliegenden freien Silikapartikel durchgeführt. Relativ früh wurde aber auch schon mit semipolaren Phasen gearbeitet, bekannt aus der RPLC, wie z. B. Cyano, Diol oder Amid (Tab. 2.1). Die freie Silikaphase ist auch heute noch eine der populärsten Materialien, reagiert aber leider sehr empfindlich auf kleine Änderungen in der Zusammensetzung der mobilen Phase. Diese Silikaphasen haben freie Silanolgruppen auf der Oberfläche, die bei einem pH-Wert unter pH-Wert 4–5 neutral vorliegen, und ermöglichen polare Wechselwirkungen wie Dipol-Dipol und Wasserstoffbrückenbindungen mit den Analyten. Wird diese Phase bei einem pH über 4–5 betrieben, so liegt diese deprotoniert vor und kann dann zusätzlich auch als Kationenaustauscher fungieren, sodass positiv geladene basische Analyten stark zurückgehalten werden.

Abb. 2.3Einordnung der stationären HILIC-Phasen (analog wie zu [2]).

Tab. 2.1Einteilung der funktionellen HILIC-Phasen und Wechselwirkungsmöglichkeiten mit entsprechenden Analyten.

Fast alle Säulenhersteller haben neben ursprünglichem Silikamaterial oben erwähnte semipolare Phasen aus dem ursprünglichen RPLC-Bestand oder aber auch neue speziell entwickelte HILIC-Phasen im Produktangebot. Einen grundsätzlichen Überblick mit detaillierter Einschätzung der polaren Wechselwirkungen für die einzelnen Phasenmaterialien kann Tab. 2.1 entnommen werden.

Die Phasen mit polaren funktionellen Gruppen werden durch Derivatisierung der entsprechenden Silanolgruppen an der Oberfläche hergestellt. Diese können dann konventionell je nach Basis des Ladungszustands der funktionellen Gruppen in neutrale, geladene oder zwitterionische Phasen eingeteilt werden (Abb. 2.3).

Neutrale stationäre Phasen enthalten polare funktionelle Gruppen, die im typischen HILIC-Bereich in ihrer Neutralform vorliegen. Somit basiert die Retention der Analyten hierbei überwiegend auf der oben erwähnten Anreicherung in der wässrigen Oberfläche und der hydrophilen Wechselwirkung mit den funktionellen Gruppen. Viele der stationären HILIC-Phasen gehören in diese Kategorie.

Die positiv geladene Aminophase ist auch eine in der HILIC oft genutzte stationäre Phase. Die funktionelle Gruppe besteht meistens aus einem Aminopropylrest mit einer primären Aminogruppe (und dem sogenannten Kohlenwasserstofflinker, „Spacer“), welche positiv geladen vorliegt, und hohe Affinität für anionische sowie saure Analyten zeigt. Aufgrund der resultierenden elektrostatischen Wechselwirkung werden diese Anionen stark an die Phase gebunden und über den Anionenaustauschmechanismus getrennt. Aminophasen können allerdings auch sehr erfolgreich für die Trennung neutraler polarer Moleküle genutzt werden, die aufgrund der hohen Hydrophilie dieser Phasen stark auf der Säule zurückgehalten werden.

Zwitterionische stationäre HILIC-Phasen sind schon in verschiedenen Versionen erhältlich und können als universellste aller HILIC-Phasen eingesetzt werden. Zwitterionische Reste enthalten sowohl eine permanente positive als auch eine permanente negative Ladung. Diese Phasen sind sehr hydrophil, beinhalten gleichzeitig moderate Ionenaustauscher-Eigenschaften. Aus diesem Grund können diese Phasen sowohl für die Trennung von neutralen, sauren als auch basischen organischen Molekülen herangezogen werden wie auch für anorganische Ionen.