HPLC optimal einsetzen

Eine gute Regel um die am besten geeignete HILIC-Phase auszuwählen, ist es zu berücksichtigen, dass neutrale Analyten in der Regel weniger hydrophil sind als die geladenen. Somit sind für die neutralen Moleküle neutrale, geladene bzw. zwitterionische Phasen entsprechend gut für die Retention des Analyten geeignet. Auf der anderen Seite sind geladene Moleküle durch deren elektrostatische Anziehungskräfte mit der entgegengesetzten geladenen Phase von HILIC-Materialien oft so stark retardiert, dass auch hier neutrale und zwitterionische Phasen oftmals das beste Ergebnis bringen.

Und es ist hier erwähnenswert, dass man in der massenspektrometrischen Detektion ja eben auch Ionen erfasst, was somit sehr kompatibel ist mit den in der HILIC-ionisch vorliegenden Analyten.

Nach der Wahl der richtigen stationären Phase steht nun die Auswahl und Optimierung der mobilen Phase an.

Wesentliche Charakteristika bei der Trennung mittels HILIC sind je nach gewählter stationärer Phase die Eigenschaften der Verteilung, der Adsorption und eventuell der elektrostatischen Wechselwirkung. Eine Gemeinsamkeit sämtlicher stationärer Phasen ist wie oben beschrieben die Fähigkeit, durch Wasseradsorption auf der Oberfläche der Partikel eine Wasserschicht ausbilden zu können. Hydrophile Komponenten werden vor allem deshalb auf den HILIC-Phasen zurückgehalten, weil sich diese bevorzugt in der ausgebildeten Wasserschicht anreichern können, wobei hydrophobere Komponenten dies nicht bzw. weniger gut tun und deshalb früh(er) eluieren.

Es ist nun wichtig zu wissen, welchen Einfluss die folgenden drei Bedingungen auf die Eigenschaften der mobilen Phase haben, die ja verantwortlich ist für den Transport der Moleküle. Diese Eigenschaften beeinflussen einerseits die Löslichkeit (bzw. die Verteilung) der Analyten in der mobilen Phase (bzw. in Kontakt mit der Wasserschicht), haben aber auch direkt Auswirkung auf die Wasserschicht auf der Partikeloberfläche selbst. Im Folgenden werden die drei Parameter (a) organisches Lösungsmittel, (b) Salz und (c) der pH-Wert einzeln erörtert.

Auf dieser Grundlage heißt es also, dass der erste (aber auch wichtigste) Parameter zur Methodenentwicklung die Art und der Gehalt an organischem Lösungsmittel in der mobilen Phase ist.

Die Art des Lösungsmittels in der HILIC ist meistens schnell gefunden (besonders, wenn man die massenspektrometrische Detektion nutzt). Die Polarität und damit die Elutionskraft der mobilen Phase kann durch die Nutzung unterschiedlicher organischer Lösungsmittel gesteuert werden. Verschiedene wassermischbare Lösungsmittel, die man verwenden kann, enthalten Alkohole oder sind zyklische Ether. Prinzipiell ist bei HILIC-Trennungen folgende abnehmende Elutionskraft von Laufmittel in der mobilen Phase festzustellen: Methanol > Ethanol > Isopropanol > Tetrahydrofuran > Acetonitril. Je stärker die Elutionskraft ist, umso schwieriger ist das Laufmittel aber zu dosieren und aufgrund der protischen Eigenschaften (der Alkohole) für die Ausbildung der Wasserschicht schlechter geeignet. Bis auf Methanol sind die Laufmittel in der Massenspektrometrie auch nur eingeschränkt bis nicht nutzbar. Somit ist Acetonitril aufgrund schwacher Elutionskraft sowie nicht protischer Eigenschaften und massenspektrometrischer Kompatibilität das meistgenutzte Lösungsmittel für HILIC-Trennungen und repräsentiert die beste Wahl für einen ersten Einstieg in die Methodenoptimierung. Also steht das organische Laufmittel schon mal fest: Acetonitril.

Das Laufmittel mit starker Elutionskraft ist (aufgrund der Notwendigkeit einer Wasserschicht auf der HILIC-Oberfläche) auch schon klar: Wasser.

Für Trennungen in HILIC (wie bei RPLC auch) gibt es nun die Möglichkeit, die mobile Phase isokratisch oder aber in einem Gradienten zu pumpen. In der Methodenoptimierung ist es meistens zweckdienlich, sich eines Lösungsmittelgradienten zu bedienen; zum einen um die Laufmittelzusammensetzung zur optimalen Elution der interessierenden Moleküle zu ermitteln und zum anderen um die Peak-Schärfung bzw. die -Forcierung zu unterstützen. So ist es essenziell, dass man zunächst die Verteilung der Analyten zwischen der mobilen Phase und der an der Oberfläche der stationären Phase befindlichen Wasserschicht berücksichtigt. In HILIC starten die Bedingungen des Gradienten bei einem sehr hohen Anteil an schwachem Elutionsmittel, d. h. typischerweise 95 % Acetonitril (maximaler Anfangsgehalt 98 % bzw. minimal 90 %). Ein Beispiel hierfür ist in Abb. 2.4 zu sehen. Die anschließende Elution retardierter Moleküle wird durch Erhöhung des starken Elutionsmittels Wasser auf typischerweise bis zu 40 % realisiert. Bei diesem Wassergehalt im Laufmittel kann die Wasserschicht auf der Partikeloberfläche nicht mehr aufrechterhalten werden und die meisten neutralen, polaren Analyten eluieren dann umgehend. In dieser Situation hat dann der Parameter „Verteilung zwischen Wasserschicht und mobiler Phase“ keinen Einfluss mehr auf die Retention der Moleküle. Auf der Oberfläche der stationären Phase vorhandene funktionelle Gruppen können dann lediglich noch adsorptive und bei geladenen Säulen auch elektrostatische Wechselwirkungen mit den Analyten ausbilden. Die Konsequenz ist zu diesem Zeitpunkt eine Co-Elution vieler polarer Moleküle und somit dort eine häufig schlechte chromatographische Trennung. Dies gilt es immer dann zu bedenken, wenn man sehr schnelle und steile Lösungsmittelgradienten nutzen möchte. In der RPLC-Anwendung funktioniert das häufig gut, in der HILIC aus oben genannten Gründen eher nicht. Zu flach sollte der Gradient aber aufgrund der ungünstigen Bedingungen (der van-Deemter-Gleichung) auch nicht sein, denn dann werden die Peaks breit (ko)eluierend und verlieren ihre Form. Ein generischer Elutionsgradient ist in Abb. 2.4 dargestellt und kann – bestehend aus einer Wasser-/Acetonitril-Mischung – als ein erster Schritt in der detaillierter werdenden Methodenentwicklung genutzt werden. So bekommt man auf jeden Fall einen ersten Eindruck über die Elutionseigenschaften der jeweils zu trennenden Substanzen und deren polaren Eigenschaften.

HILIC reagiert – wie bereits erwähnt – im Betrieb sehr viel empfindlicher gegenüber Laufmitteländerungen als die RPLC. Aus diesem Grund sind hier die noch weitere Informationen bzw. Vorsichtsmaßnahmen beschrieben, die Ihnen bei der Methodenoptimierung weiterhelfen können, und die Sie auch berücksichtigen sollten: So ist das Lösungsmittel der zu injizierenden Probe immer kritisch. Da hohe lokale wässrige Anteile wie in einer Wasserprobe die fragile wässrige Schicht auf der Oberfläche der stationären Phase zerstört, sind diese Proben bisher eben problematisch. Halten Sie den Gehalt an Acetonitril je nach Analyt so hoch wie möglich. Methanol bis zu 20 % kann die Löslichkeit des Analyten unterstützen. Auf jeden Fall sollte der Wassergehalt in der zu injizierenden Probe unter 5 % gehalten werden oder aber die Wasserprobe langsam einbringen. So ermöglichen es langsame Injektionen von geringen Volumina beispielsweise wässrigen Proben über eine Vermischung mit der mobilen Phase vor Auftreffen auf die stationäre Phase geeigneten Bedingungen zuzuführen und somit keine Veränderung der Säulenoberfläche hervorzurufen. Weitere Möglichkeiten, Wasser zu injizieren, finden Sie am Ende des Kapitels. Ebenso sind Waschlösungen der Injektionsnadel kritisch. Verwenden Sie immer Acetonitril mit 5–10 % Wasser ohne Zusatz von Säuren oder Salzen, denn alles andere kann die Zusammensetzung des Laufmittels bei der Injektion kurzfristig ein klein wenig verändern und das führt oftmals schon zu unreproduzierbaren Änderungen in der Retentionszeit. Ebenso sind vorgemischte Lösungsmittel eine problematische Sache, v. a. dann, wenn unterschiedliche Anwender Laufmittel unterschiedlich herstellen. Die Retention bei HILIC verändert sich teilweise schon sehr drastisch auch bei kleinen Änderungen des Wasser- (und Salz-)Gehaltes. So ist es notwendig, dass es sehr detaillierte Handlungsanweisungen im Labor gibt, die genau wiedergeben, wie das Laufmittel hergestellt wird bzw. werden soll. Die Nutzung von industriell vorgemischten bzw. immer im gleichen Verfahren hergestellten Acetonitril/Wasser- lösungen hilft die Reproduzierbarkeit der Analysen zu erhöhen.