Julio C. Rojas - Temas selectos en ecología química de insectos

Extracción con disolventes

En este método los compuestos de interés pueden ser extraídos sumergiendo los tejidos del material biológico en estudio en un disolvente por un determinado tiempo o bien pueden ser extraídos con un Soxhlet. El tiempo de extracción dependerá del tipo de compuestos que deseemos extraer. Por ejemplo, si queremos extraer los lípidos cuticulares de un tejido, entonces con sumergir el material unos cuantos segundos o minutos será suficiente, pero si estamos interesados en extraer compuestos internos de los tejidos, entonces el material deberá permanecer en el disolvente varias horas o días. En algunos casos se calienta el disolvente para acelerar el proceso de extracción, esto se hace cuando se intenta extraer compuestos no volátiles o compuestos que no se degradan con el calor. El método de extracción con disolvente ha sido ampliamente usado para extraer las feromonas sexuales de lepidópteros, básicamente consiste en estrujar el cuerpo de la hembra, de tal forma que expongan los últimos segmentos abdominales en donde se encuentran las células productoras de la feromona, los cuales son cortados y sumergidos en un pequeño vial conteniendo 200 μL de hexano o cloruro de metileno durante minutos a una hora. Entre menos tiempo permanezca el tejido en el disolvente, menos posibilidades habrá de extraer lípidos, que pueden interferir con el análisis químico de los extractos. Este método también ha sido usado ampliamente para extraer hidrocarburos cuticulares y metabolitos secundarios de las plantas que mediatizan el comportamiento de alimentación y oviposición de los insectos. Cuando se use este método se debe tener cuidado de utilizar un disolvente limpio grado HPLC y lavar perfectamente los recipientes de vidrio utilizados para la extracción.

Muestreo de volátiles

En esta sección describiremos brevemente los métodos para muestrear los compuestos volátiles.

Aireación dinámica

La aeración dinámica es el método más usado para muestrear los volátiles emitidos por insectos y plantas. Este método consiste en pasar un flujo de aire para arrastrar los compuestos volátiles emitidos por el organismo, el cual está contenido dentro de un recipiente y capturarlos en filtros con adsorbentes (Heath & Manukian, 1992). Los recipientes usados para contener el material a muestrear pueden ser de vidrio o de plástico, los primeros tienen menores niveles de impurezas, pero son más caros y frágiles, los segundos son más versátiles y pueden ser muy útiles para la captura de volátiles de plantas en el laboratorio y en campo. Se han usadas bolsas de diversos materiales en diferentes trabajos, incluyendo polietileno, poliéster, poliacetato, polietileno de tereftalato y polivinilacetato (Stewart-Jones & Poppy, 2006). También diferentes adsorbentes para la captura de volátiles de insectos y plantas, los más utilizados son Porapak Q, Super Q, Tenax y carbón activado. Algunos adsorbentes como Porapak Q o Tenax necesitan ser tratados antes de usarse debido a las impurezas que contienen o bien usar versiones más limpias de estos adsorbentes tales como Super Q y Tenax TA. El tratamiento de los adsorbentes consiste en colocarlos dentro de un tubo de vidrio y calentarlos a 200 (Porapak Q) o 270-340 ºC (Tenax) durante varias horas pasando un flujo de N 2dentro del tubo para evitar que el adsorbente se queme, posteriormente el adsorbente es lavado con pentano, cloruro de metileno o éter usando un Soxhlet (Millar & Sims, 1998). Los adsorbentes son usualmente contenidos o empacados dentro de tubos de vidrio (p. ej. una pipeta Pasteur) con lana de vidrio o malla metálica. Los tubos empacados con adsorbente pueden ser obtenidos de casas comerciales tales como SKC y ARS en los EUA, la primera compañía tiene distribuidores en varios países de Latinoamérica y la segunda puede ser fácilmente contactada vía Internet. El aire que arrastra los compuestos volátiles pasa a través del adsorbente a una tasa de flujo constante durante el proceso de muestreo.

Los sistemas de colecta que muestrean los volátiles por aeración dinámica pueden ser cerrados o abiertos (Tholl et al., 2006). En el sistema del primer tipo, conocido en inglés como “closed-loop stripping”, el aire junto con los volátiles emitidos por el organismo se hacen circular mediante una bomba de diafragma y capturados en el adsorbente dentro de una cámara cerrada (p. ej. desecador de vidrio de 750mL) (Seidelmann et al. , 2000) (Figura 1). Los contaminantes son minimizados debido a que el aire circula dentro de un ambiente cerrado. Los volátiles atrapados pueden ser recuperados con disolventes o termodesorbidos. Un modelo comercial de este sistema es vendido por Brechühler AG, una compañía de Suiza. Este sistema ha sido usado para muestrear feromonas de insectos y volátiles vegetales inducidos por herbivoría y volátiles florales (Bestmann et al., 1988; Tholl et al., 2006).

Figura 1.Técnica de colecta de volátiles “closed-loop-stripping” usada con langostas. 1. Baño maría; 2. Desecador; 3. Refrigerante para enfriamiento; 4. Sistema de calentamiento; 5. Filtro de carbón activado; 6. Flujómetro; 7. Carbón activado; P. Bomba (tomada de Seidelmann et al. 2000).

En la colecta de volátiles por aeración dinámica abierta se puede extraer o empujar-extraer el aire del exterior dentro de la cámara de colecta (Tholl et al., 2006). En un sistema del tipo “extraer” se usa una bomba de vacío conectada a un flujómetro que a su vez se conecta al tubo con el adsorbente que atrapará los volátiles jalados por la bomba. El material a muestrear se coloca en un recipiente abierto o cerrado, en el primer caso hay un mayor riesgo de colectar impurezas del ambiente, el cual es minimizado al contener el material dentro de un recipiente de vidrio o una bolsa. En este caso, el aire del ambiente entra al recipiente a través de un filtro de carbón activado y es retirado de éste al extraer un volumen definido a través del tubo con el adsorbente. En un sistema del tipo “empujar-extraer”, el aire del exterior es primeramente purificado por una trampa de carbón activado, y después pasa por un flujómetro que regula el volumen de aire que entra al recipiente, el aire junto con los volátiles es extraído hacia el tubo con el adsorbente a un volumen menor al que ingresó por medio de otro flujómetro, el cual es conectado a la bomba de vacío.

Otro método de aeración dinámica es el llamado análisis por desadsorción térmica y purga-trampa (Figura 2), aunque su uso en ecología química ha sido limitado (Millar & Sims, 1998). La técnica consiste en colocar el material a muestrear en un recipiente y los compuestos volátiles son arrastrados por aireación y capturados en un adsorbente. El adsorbente que contiene los volátiles es purgado con un gas inerte (para remover agua, principalmente) y desadsorbido por calentamiento directamente en un cromatógrafo de gases. Una desventaja a considerar con este método es la posible formación de contaminantes debido a la degradación de la muestra o del adsorbente por calor (Millar & Sims, 1998). En el mercado existen varios modelos comerciales para el análisis purga-trampa (Supelco, Scientific Instrument Services, Perkin Elmer, Carlo Erba, Tekmar). Una de las aplicaciones de esta técnica fue en el análisis de atrayentes de fruta fermentada o madura (Cossé et al. , 1995). Posteriormente, Drijfhout et al. (2000) reportaron la aplicación de la desadsorción térmica en el análisis de la feromona sexual de Adoxophyes orana (Lepidoptera: Tortricidae) and Campylomma verbasci (Heteroptera: Miridae) a partir de un solo insecto mediante esta técnica.