José F. Pertusa Grau - Técnicas de análisis de imagen, (2a ed.)

No siempre se precisa del procesado de la imagen para realizar el análisis de imagen. El recuento de eritrocitos con una cámara cuentaglóbulos es uno de esos casos. La técnica preparatoria asegura que el recuento se pueda llevar a cabo con solo cargar la cámara de recuento; entonces el experimentador puede comprobar que unos discos refringentes, los eritrocitos, se encuentran esparcidos sobre una rejilla cuadriculada. El análisis acaba cuando obtenemos el número de eritrocitos contenidos en un número de cuadrículas determinado, esto es, en un área de referencia.

1.2 Tipos de imagen con interés biológico

Las imágenes biológicas se generan por interacción de las ondas electro-magnéticas con los objetos biológicos. En realidad todas las imágenes cotidianas del mundo que nos rodea se generan de forma semejante, aunque nuestra apreciación de lo cotidiano a veces no nos permite percatarnos de manera consciente del mecanismo por el que un objeto se hace visible a nuestros ojos. Pero como el presente manual va dirigido especialmente a los estudiantes del área de biología, nos vamos a centrar en las imágenes que con mayor frecuencia se manejan en esta disciplina.

1.2.1 Ondas electromagnéticas transmitidas

Se trata del sistema que utiliza la microscopía de transmisión. Una fuente de ondas electromagnéticas, que suele ser una bombilla en el caso de la microscopía óptica y un filamento incandescente en la microscopía electrónica (aunque en este caso la luz es un haz de electrones), genera un rayo que atraviesa la muestra biológica que se encuentra interpuesta en su camino. En la interacción de la luz con el espécimen se produce la absorción, reflexión y refracción de la luz al atravesar las distintas estructuras que componen el material biológico, con lo que la luz se desvía de su recorrido y se produce una imagen con regiones de luces y sombras.

El fenómeno de interferencia se puede incrementar con la adición de colorantes o contrastantes, según sea el caso, con distinta afinidad por los elementos de la muestra; entonces se produce la absorción de determinadas bandas del espectro de luz y de esa manera se pueden observar, en microscopía óptica, partes con diversas coloraciones que hacen más evidentes y más contrastadas las diferentes porciones de la muestra. La aplicación de contrastantes en micros-copía electrónica de transmisión hace que algunos elementos de la muestra se mantengan permeables a los electrones, mientras que otros se hagan opacos a los mismos, con lo que se produce igualmente el incremento de contraste entre los orgánulos celulares. La imagen que se genera está compuesta por zonas más o menos claras, según la concentración de los colorantes o la presencia de sustancias opacas a los electrones. Nótese que las imágenes de microscopía óptica están dotadas de color, mientras que las procedentes de microscopía electrónica son imágenes monoespectrales.

En todos los casos la característica común es que la dirección del haz de luz y la posición de la muestra forman un ángulo de 90 grados. Los fenómenos de reflexión no intervienen de manera importante en la formación de este tipo de imágenes, con excepción de ciertos casos, por lo que la imagen rara vez nos produce sensación de profundidad: se trata de imágenes, literalmente, planas.

Fig. 1.2 Epitelio de la cara inferior de la lengua del ratón. Micros-copía óptica de luz transmitida.

Fig. 1.3 Células hematopoyéticas de la dorada ( Sparus aurata ). Microscopía electrónica de transmisión. (Imagen cedida por el Dr. J. Meseguer. Departamento de Biología Celular. Universidad de Murcia).

1.2.2. Ondas electromagnéticas reflejadas

Este es el mecanismo que todos conocemos en la generación común de las imágenes que percibimos en la vida cotidiana. La luz procedente de una o diversas fuentes incide sobre los objetos y se refleja en ellos con un ángulo que depende del propio ángulo de incidencia del haz de radiación y de la geometría de la superficie del objeto. Además de las propias características de los objetos que hacen que se absorba una determinada cantidad de luz de un espectro determinado, la disposición relativa de la fuente de luz y la muestra hace que se obtengan sombras que le dan a la imagen sensación de profundidad.

Aparatos como los microscopios estereoscópicos, las lupas, nos proporcionan imágenes de este tipo. El microscopio de barrido genera imágenes parecidas a las descritas, aunque en realidad la imagen se produce por otro mecanismo más parecido al que trataremos a continuación, la emisión de ondas electromagnéticas. A pesar de todo, la imagen producida por este tipo de microscopio electrónico nos produce la sensación de que se trata de imágenes obtenidas por luz reflejada, porque la posición de las sombras simula esos dibujos artísticos al carboncillo en los que la profundidad la obtenemos por los bordes difusos del sombreado.

Fig. 1.4 Imagen de un embrión de pollo obtenida con un microscopio estereoscópico.

Fig. 1.5 Alga del fitoplancton ( Emiliania huxleyi ). Microscopía electrónica de barrido. (Imagen cedida por el Dr. J. Alcober. Departamento de Botánica. Universitat de València).

1.2.3 Ondas electromagnéticas emitidas

El tercer tipo de imagen es aquel que se produce cuando el propio objeto es el que emite la luz (o los electrones). Son muy raros los casos en los que un objeto emite luz por si mismo, sin estimulación previa del experimentador, pero incluyen un fenómeno de interés biológico como es la bioluminiscencia. Con una cámara suficientemente sensible se puede obtener una imagen de una luciérnaga, por ejemplo, o de la traza que deja durante su vuelo.

Pero el mecanismo más común que produce imágenes biológicas de este tipo es el fenómeno conocido como fluorescencia. Determinadas sustancias son capaces de absorber fotones muy energéticos al ser iluminadas con una luz de una longitud de onda específica (luz incidente) y liberar parte de esa energía absorbida como fotones de menor energía. La forma más frecuentemente utilizada es la aplicación de fuentes de luz azul, violeta o ultravioleta, que producen la emisión de luz roja, amarilla, verde o azul por las muestras biológicas.

Podemos encontrar muy diversos instrumentos biológicos que utilizan el principio de la fluorescencia para analizar las muestras; destacamos el propio microscopio de epifluorescencia, con el que se observan muestras microscópicas tratadas previamente con colorantes fluorescentes específicos o con trazadores marcados con estos colorantes. Los lectores de electroforesis para ácidos nucleicos utilizan como principio la afinidad específica de los nucleótidos por sustancias fluorescentes, como el bromuro de etidio, para iluminarlas posteriormente con luz ultravioleta y determinar las acumulaciones de estas moléculas en bandas según su peso molecular y la carga eléctrica.

Fig. 1.6 Bandas electroforéticas de ADN en un gel de agarosa. Fluorescencia de bromuro de etidio.