Коллектив авторов - Морфологическая диагностика. Подготовка материала для гистологического исследования и электронной микроскопии

При заливке в целлоидин материала, фиксированного по Буэну, часто обнаруживается, что даже после длительного пребывания в растворе целлоидина препараты пропитываются не полностью и крошатся при резке. Для устранения этого недостатка рекомендуется после 96 %-го спирта переносить препараты на 10 – 48 ч в следующую масляную смесь: 10 мл кедрового масла, 80 мл абсолютного спирта, 20 мл ориганового масла, 10 мл азотной кислоты. После этого объекты снова помещают на 24 – 48 ч в 96 %-й спирт, который сменяют 2 – 3 раза. Далее проводят те же манипуляции, как при целлоидиновой заливке. После такой обработки препараты хорошо режутся и не крошатся. Предполагается, что хрупкость объектов обусловлена образованием пикрата калия, который препятствует проникновению целлоидина; масляная смесь, содержащая азотную кислоту, растворяет и удаляет его (Ромейс Б., 1954).

Полигексаметиленгуанидин относится к фиксаторам общего назначения, предложенным в последние годы. Он применяется (Аничков Н. М.[и др.], 2010) в виде 10 %-го водного раствора (время фиксации – 5 сут).

Ацетат меди (Арасланов С. А. [и др.], 2007), тоже фиксатор общего назначения, применяется в виде 0,2 М водного раствора, время фиксации в нем составляет 7 сут.

Проведение иммуноцитохимического исследования возможно после фиксации материала в нейтральном растворе формалина, спирт-формалине, жидкостях Карнуа и Буэна, фиксаторах СФУ и B5. Наиболее устойчивые антигены могут быть выявлены и после продолжительной фиксации в обычном (не нейтральном) 10 %-м растворе формалина. Однако при использовании этих фиксаторов часть антигенов маскируется в связи с конформационными изменениями белков, экстракцией липидов, образованием перекрестных сшивок, модифицирующих антигенные детерминанты, снижается интенсивность иммуноцитохимической реакции на большинство антигенов.

С целью улучшить сохранность тканевых антигенов были предложены специальные фиксирующие смеси, которые наряду с фиксацией материала обеспечивают сохранность отдельных групп антигенов. Их использование вместо формалина позволяет во многих случаях добиться более эффективного выявления различных тканеспецифических белков, ферментов и онкомаркеров.

Цинк-формалин имеет наибольшее значение среди предложенных фиксаторов, поскольку он обеспечивает качество фиксации, свойственное формалиновым растворам. При применении обзорных и наиболее распространенных специальных способов окраски тинкториальные свойства тканевых элементов существенно не меняются, так что при проведении обычного патогистологического исследования не возникает дополнительных трудностей. Кроме того, для приготовления цинк-формалина не требуется использования дефицитных или дорогостоящих реагентов.

Цинк-формалиновый фиксатор с хлоридом цинка (Naish S. J., 1989) готовят, растворяя в 2 л дистиллированной воды 50 г хлорида цинка и добавляя 300 мл концентрированного раствора формальдегида и 1,9 мл ледяной уксусной кислоты. Этот фиксатор обычно применяют для иммуноцитохимических исследований, поскольку он хорошо сохраняет белки, ассоциированные с клеточными мембранами. Продолжительность фиксации – не более 24 ч при комнатной температуре. Приготовленный фиксатор может храниться в течение нескольких недель.

Цинк-формалиновый фиксатор с сульфатом цинка (Kiernan J. A., 2008). Для приготовления фиксатора берут 900 мл дистиллированной воды, 100 мл концентрированного раствора формальдегида и 10 г сульфата цинка (ZnSO 44··7H 2O). Считается, что лучший результат фиксации антигенов получается при pH = 4,0 – 6,5. Если pH приготовленного раствора выходит за указанные границы, следует использовать 1 М растворы HCl и NaOH, которые добавляют к раствору фиксатора по каплям до необходимого уровня pH. Цинк-формалиновый фиксатор с сульфатом цинка может быть использован для перфузионной фиксации лабораторных животных. Для иммерсионной фиксации небольших объектов достаточно 6 – 8 ч. Объекты можно оставить в фиксаторе на срок до 1 нед. После фиксации в цинк-формалине можно заливать объекты в парафин (после промывки в воде), изготовлять срезы незалитого материала на замораживающем микротоме и криостате.

Раствор параформальдегида с пикриновой кислотой, по Замбони. Первоначально этот фиксатор был предложен (Zamboni L. [et al.], 1967) для электронной микроскопии. Способ приготовления: 20 г параформальдегида растворяют в насыщенном водном растворе пикриновой кислоты (150 мл). Раствор нагревают до 60 °C. Для улучшения растворения параформальдегида необходимо добавить в раствор 2 – 5 капель 1 М (4 %) водного раствора NaOH. После растворения параформальдегида раствор фильтруют, охлаждают и доводят до 1 л при помощи фосфатного буфера.