Коллектив авторов - Морфологическая диагностика. Подготовка материала для гистологического исследования и электронной микроскопии

– метилсалицилат (или метилбензоат) – 12 – 24 ч.

В метилсалицилате материал можно долго хранить без ухудшения качества препаратов (Коржевский Д. Э., 1996; Коржевский Д. Э. [и др.], 2008). Так как проводка через метилсалицилат и метилбензоат приводит к смягчению плотных объектов, ее полезно использовать при обработке кусочков кожи и органов, содержащих много мышечной и соединительной ткани.

Ускорения процесса обезвоживания можно добиться, вырезая кусочки тканей меньшего размера (например, 1,0 × 0,5 × 0,2 см), обеспечивая постоянное перемешивание растворов (например, в автоматизированной системе гистологической проводки) и проводя обезвоживание при 37 °C в термостате. Большее повышение температуры растворов не рекомендуется в связи с опасностью сжатия и чрезмерного уплотнения тканей. Плотные объекты (кожа, декальцинированная кость) не следует обезвоживать при повышенной температуре.

Для обезвоживания маленьких кусочков (размерами до 1,0 × 0,5 × 0,3 см) можно рекомендовать следующие схемы ручной проводки.

Первая схема:

– этанол 80 %-й – 6 – 8 ч;

– этанол 96 %-й (I) – 12 – 24 ч;

– этанол 96 %-й (II) – 4 – 24 ч;

– этанол абсолютный – 2 – 4 ч (при комнатной температуре).

Вторая схема:

– этанол 80 %-й – 6 – 8 ч;

– этанол 96 %-й (I) – 12 – 24 ч;

– этанол 96 %-й (II) – 6 – 24 ч;

– этанол 96 %-й (III) – 3 – 5 ч (при комнатной температуре).

Третья схема:

– этанол 80 %-й – 2 – 4 ч;

– этанол 96 %-й (I) – 6 – 18 ч;

– этанол 96 %-й (II) – 2 – 4 ч;

– этанол 96 %-й (III) – 2 – 4 ч (при температуре 37 °C).

Высокое качество обезвоживания может быть достигнуто только при использовании этанола соответствующей крепости. Поэтому качество спирта необходимо проверять с помощью ареометра. Абсолютный спирт пригоден для обезвоживания (в качестве абсолютного спирта), если его крепость не ниже 98 %. Объем обезвоживающего раствора должен не менее чем в 10 раз превышать объем погруженных в него обезвоживаемых объектов. Абсолютный этанол можно заменить абсолютированным изопропанолом (99 %). Пригодна для этого и смесь абсолютированного изопропанола и этанола 96 %-го (1: 1).

Получение тонких срезов образцов исследуемых тканей возможно только после пропитывания последних достаточно плотными средами, какими являются парафин и целлоидин. В настоящее время целлоидин применяется очень редко.

Парафин– смесь высокомолекулярных предельных углеводородов, получаемая при перегонке нефти. Сорта парафина, используемые в качестве среды для гистологической заливки, имеют температуру плавления от 48 до 60 °C. Наиболее удобен в повседневной работе парафин с температурой плавления 52 – 56 °C. Без дополнительной подготовки технический, пищевой и медицинский парафины не позволяют производить заливку, обеспечивающую высокое качество срезов. В гистологической лаборатории желательно использовать очищенные сорта парафина с добавлением восков или специально разработанные на основе парафина среды с модифицирующими добавками, такие как гистомикс («БиоВитрум», Россия), Paraplast (Sigma, США), Histoplast (Shandon, США).

Пропитку парафином проводят в термостате, обеспечивающем поддержание температуры на 1 – 2 °C выше температуры плавления используемого парафина (обычно устанавливают температуру 58 °C).

Поскольку расплавленный парафин и этанол не смешиваются, из обезвоженного материала следует удалить спирт (или метилсалицилат, если он был использован для длительного хранения объектов) при помощи промежуточной среды – растворителя парафина, смешивающегося с этанолом. В качестве промежуточной среды можно использовать хлороформ, авиационный бензин (рекомендован Р. Лилли, 1969), петролейный эфир, ксилол, бензол, толуол, октан, гексан и др. В практической работе наиболее часто применяют хлороформ и ксилол. Неудовлетворительное качество заливки при использовании хлороформа может быть обусловлено применением хлороформа «для спектроскопии», в который добавлен этанол, разливного хлороформа (при использовании недостаточно просушенных после промывки емкостей) и реактива, долго хранившегося на свету. При доступности абсолютного этанола следует предпочесть менее токсичный петролейный эфир, который лучше удаляет этанол и позволяет достичь более высокого качества пропитки парафином.

Можно рекомендовать следующие схемы ручной проводки и пропитывания материала.

Заливка в парафин с использованием хлороформа.Обезвоженные объекты помещают последовательно в следующие среды: