Коллектив авторов - Морфологическая диагностика. Подготовка материала для гистологического исследования и электронной микроскопии

Контроль за ходом декальцинации осуществляют в сочетании с заменой декальцинирующей жидкости. При использовании в качестве декальцинаторов слабых кислот тестирование на завершение декальцинации обычно проводят ежедневно. Для контроля последнего используют различные тесты (Некачалов В. В., 2000). Наиболее простыми являются пробный надрез, прокалывание кусочка препаровальной иглой . Для выполнения тестов требуется некоторый практический опыт, так как ни один из тестов не может быть признан удовлетворительным.

Химические тесты основаны на определении содержания кальция в декальцинирующей жидкости. Кальций-оксалатный методпозволяет обнаруживать в ней кальций за счет преципитации нерастворимых гидроокиси и оксалата кальция. Берут 3 мл использованной декальцинирующей жидкости, опускают в нее маленький кусочек лакмусовой бумаги и добавляют по каплям концентрированный (25 %) водный раствор аммиака до тех пор, пока раствор не станет нейтральным (взбалтывают после добавления каждой капли). Затем добавляют примерно 5 мл насыщенного при комнатной температуре раствора оксалата аммония, хорошо взбалтывают и оставляют на 30 мин. Образование преципитата свидетельствует о том, что в декальцинирующей жидкости имеется значительное количество кальция. Если исследуемая жидкость остается прозрачной в течение 30 мин, то декальцинация завершена.

1. Некачалов В. В. Патология костей и суставов. – СПб.: Сотис, 2000. – 285 с.

2. Merchan-Perez A., Gilloyzaga P., Bartolome M. V. [et al.]. Decalcification by ascorbic acid for immuno- and affinohistochemical techniques on the inner ear // Histochem. Cell Biol. – 1999. – Vol. 112. – P. 125 – 130.

Обезвоживание фиксированных объектов обязательно предшествует их заливке в парафин. Из фиксированных объектов можно готовить срезы и без заливки при помощи замораживающего микротома (замораживающего столика) и вибратома.

Перед обезвоживанием материала производят подготовку фиксированных кусочков органов и тканей для гистологического исследования (вырезку). Вырезанные кусочки должны иметь толщину не более 0,8 см (оптимально – 0,3 – 0,5 см), длину и ширину в пределах 1,5 – 2,0 см, т. е. не более длины сторон стандартного покровного стекла. При использовании для проводки гистологических кассет размеры кусочка ткани ограничиваются размерами кассеты. Не рекомендуется изготавливать слишком крупные кусочки, так как если они будут плотно прилегать к стенкам кассеты, то пропитка материала растворами в этом месте будет плохая. Также не рекомендуется складывать несколько кусочков тканей в одну кассету, поскольку они могут слипнуться и плохо пропитаться.

Перед проводкой материала кусочки органов и тканей, которые были фиксированы в формалине, промывают в проточной воде (до 24 ч) и подсушивают на фильтровальной бумаге.

Для обезвоживания материала обычно используют несколько порций этилового спирта восходящей крепости. Для материала, фиксированного в формалине, рекомендуется начинать с 70 – 80 %-го этанола, в котором объекты могут находиться длительное время без существенного сжатия и изменения тинкториальных свойств. Кроме этанола для обезвоживания может быть применен безводный ацетон, изопропанол, диоксан, глицерин. Обезвоживание ускоряется при постоянном перемешивании жидкости, которое обеспечивают автоматизированные системы проводки карусельного типа (Sakura Rotary Tissue Processor, Leica TP1020, Microm STP 120, АТ-5).

Продолжительность пребывания объектов в спирте обусловлена их размерами, свойствами тканей и особыми задачами исследования (например, необходимостью максимального удаления липоидов из нервной ткани перед заливкой в целлоидин и окраской по Нисслю).

Для обезвоживания кусочков обычного размера (1,0 – 2,0 × × 1,0 – 1,5 × 0,5 – 0,8 см) можно рекомендовать следующие схемы ручной проводки (при комнатной температуре без постоянного перемешивания).

Первая схема:

– этанол 80 %-й – 18 – 24 ч;

– этанол 96 %-й (I) – 18 – 24 ч;

– этанол 96 %-й (II) – 18 – 24 ч;

– этанол абсолютный – 6 – 24 ч.

Вторая схема:

– этанол 80 %-й – 18 – 24 ч;

– этанол 96 %-й (I) – 18 – 24 ч;

– этанол 96 %-й (II) – 18 – 24 ч;

– этанол 96 %-й (III) – 18 – 24 ч.

Третья схема:

– этанол 80 %-й – 18 – 24 ч;

– этанол 96 %-й (I) – 18 – 24 ч;

– этанол 96 %-й (II) – 18 – 24 ч;

– метилсалицилат (или метилбензоат) – этанол 96 %-й (1: 1) – 2 ч;