Е. Бессолицына - Биохимия метаболизма. Учебное пособие

Гипотеза Митчелла о сопряжении окисления и фосфорилирования протонным градиентом получила к настоящему времени множество подтверждений.

1. Согласно Митчеллу, первичным событием в окислительном фосфорилировании является транслокация протонов (Н +) на наружную сторону сопрягающей мембраны (внутренней митохондриальной мембраны), осуществляемая за счет процесса окисления в дыхательной цепи. При этом предполагается, что мембрана непроницаема для ионов вообще, особенно для протонов, которые накапливаются на наружной стороне мембраны, создавая по обе стороны мембраны разность электрохимических потенциалов (Δμн). Она складывается из химического потенциала (разность рН) и электрического потенциала.

Разность электрохимических потенциалов обеспечивает действие локализованной в мембране АТФ-синтазы(или обращение процесса, катализируемого локализованной в мембране АТФ-гидролазой), которая в присутствии Ф н-+ AДФ синтезирует ATФ. Таким образом, нет необходимости в высокоэнергетическом промежуточном соединении, общем для процессов окисления и фосфорилирования, как это постулирует химическая гипотеза.

Протонный градиент через внутреннюю митохондриальную мембрану создается во время переноса электронов. рН с наружной стороны на 1,4 единицы ниже, чем с внутренней, и мембранный потенциал составляет 0,14 В, причем наружная сторона несет положительный заряд. Общий электрохимический потенциал Δр (в вольтах) складывается из мембранного потенциала (ΔΨ) и градиента концентрации ионов Н +(ΔрН). В приведенном ниже уравнении R -газовая постоянная, Т – абсолютная температура, F- число Фарадея.

как видно из уравнения в него входят два компонента электрический (Δψ) и химический (RT/F*ΔрН). Электрический компонент связан с запасанием энергии, в данном случае наблюдается следующая картина:, за счет переноса протонов, водный раствор межмембранного пространства заряжен положительно, а водная часть матрикса митохондрии наоборот отрицательно, а мембрана за счет гидрофобного билипидного слоя выступает в роли прослойки из диэлектрика (это похоже на две заряженные пластины, разделенные слоем диэлектрика – а это уже конденсатор). В случае разницы в концентрациях протонов между двумя указанными выше компартментами – это тоже форма запасания энергии. Известно, что на создание градиентов затачивается энергия АТФ, например работа К/Na-АТФ-азы. При подстановке результатов, полученных при измерении, в уравнение можно получить результаты приведенные ниже.

Эта общая протонодвижущая сила в 0,224 В соответствует свободной энергии 5,2 ккал в расчете на 1 моль протонов. Следовательно для синтеза одного моля АТФ необходим перенос 2 моль протонов.

2. При создании градиента рН в митохондриях или хлоропластах в них происходит синтез АТР в отсутствие переноса электронов.

3. Белок пурпурных мембран галобактерий при освещении перекачивает протоны. Синтетические пузырьки, содержащие этот бактериальный белок и очищенную АТР-азу из митохондрий сердца крупного рогатого скота, синтезируют АТФ при освещении. В этом опыте белок пурпурных мембран заменяет дыхательную цепь; следовательно, дыхательная цепь и АТФ-аза – биохимически отдельные системы, связываемые только протонным градиентом.

4. И дыхательная цепь, и АТФ-аза имеют векторную организацию во внутренней митохондриальной мембране.

5. Для окислительного фосфорилирования существенное значение имеет замкнутость компартментов. В растворимых препаратах или в мембранных фрагментах, лишенных хорошо отграниченных внутренних и внешних компартментов, не происходит синтеза АТФ, сопряженного с переносом электронов.

6. Вещества, переносящие протоны через внутреннюю митохондриальную мембрану, разрушают протонный градиент и таким образом вызывают разобщение окисления и фосфорилирования.

7. Компоненты дыхательной цепи уложены в мембране упорядоченно, «бок о бок», поперек мембраны, как предусматривается хемиосмотической теорией.

Второй важный факт это точки переноса протонов, или точки генерации протонного градиента, так как естественно, что в каждой реакции генерация не происходит. Следовательно важным моментом является определение количества и положения точек генерации протоннного градиента.