Михаил Супотницкий - Биологическая война (Часть 3)

| Размер по количеству повторов

Локус а| Размер повтора в нуклеотидах б| наименьший | наибольший | Количество аллелей | Индекс разнообразия ( D )

vrrA | 12 | 2 | 6 | 5 | 0,50

vrrB 1| 9 | 15 | 23 | 5 | 0,32

vrrB 2| 9 | 11 | 15 | 3 | 0,34

vrrC 1| 36 | 4 | 12 | 6 | 0,55

vrrC 2| 18 | 17 | 19 | 3 | 0,50

CG 3 | 5 | 1 | 2 | 2 | 0,35

pXO1-aat | 3 | 4 | 11 | 8 | 0,81

pXO2-at | 2 | 6 | 15 | 9 | 0,79

Avg | | | | 5,1 | 0,52

а— курсивом показаны маркеры, обнаруженные в ORP; б— vrr B -повторы не являются идентичными. Отдельные из них содержат множественные нуклеотидные различия; vrrC -маркеры содержат 9 вырожденных субповторяюгцихся структур; D — индекс разнообразия подсчитывается как 1—∑ (аллельная частота) 2.

У В. anthracis от двух до шести копий VNTR расположены в пределах открытой рамки считывания гена, обозначенного как vrrA ^ variable region with repetitive sequence). Ген vrrA кодирует белок с ММ 30 кДа, гомологичный микрофилярному белку SHP2 оболочки паразитного червя Litomosoides carinii (Andersen G. L. et al., 1996). To, что ген эволюционно законсервирован среди бактерий, свидетельствует о функциональной активности кодируемого им белка, но эта функция не установлена (Jackson R J. et al., 1997). Ген vrrC кодирует полипептид ДНК-транслоказу (DNA translocase) и обычно содержит триплетный VNTR. Обнаруженный в хромосоме бактерии триплет VNTR указывает на локализацию в данном участке структурного гена (Keim R et al., 2009).

Такие локусы амлифицируют ся в ПЦР с использованием праймеров, комплементарных их фланкирующим последовательностям. Аллельные варианты VNTR-локусов хорошо разделяются в агарозном геле. Размер аллелей может быть установлен путем сопоставления со стандартными маркерами ММ. Их количественный анализ позволяет классифицировать различные штаммы В anthracis в зависимости от числа повторов и аллельных вариаций повторов. Сам факт присутствия VNTR-локусов в геноме разных видов бактерий, возможно, связан с тем, что ДНК-полимераза катализирует синтез нуклеиновой кислоты через короткий тандем повторяющихся последовательностей. Они и являются тем, что мы называем «VNTR» (Keim P. et al., 2009).

Поданным MLVA-анализа, штаммы В. anthracis делят на три линии (А, В, С), среди которых A-клада (линия, группа, кластер) является наиболее значимой (до 90 % всех штаммов) и имеет глобальное распространение. К линии В относятся в разных исследованиях обычно менее 12 % изолятов. Встречается только в некоторых географических регионах. Ее подразделяют еще на две группы, В1 и В2. На Юге Африки 93 % изолятов В. anthracis представлены группой В1, где линия сосуществует со штаммами A-клады. Штаммы В. anthracis группы В2 встречаются в Швейцарии, странах Южной и Восточной Европы. Штаммы линии А подразделяют еще на 4 группы (кластера). Изоляты кластера А1 доминируют на западе Северной Америки и в Канаде (генотипы 1 и 3), встречаются в Южном Техасе (генотип 6). А2-ветвь встречается среди отдельных изолятов, привезенных из Пакистана. АЗ- кластер — самый распространенный из всех известных (до 58 % изолятов). Вызывает вспышки сибирской язвы на юге Африки (генотипы 30, 40, 67); в Австралии (штат Виктория, генотип 66), в Турции (генотип 35). Этой ветви соответствуют v звестные вакцинные штаммы V770-NPR (генотипы 45,46 и 49) и Стерн (генотипы 59 и 61). Ames, любимый штамм американских военных биологов (генотип 62), находится в АЗ.Ь-кластере. Кластер А4 недостаточно изучен. С-клада встречается редко и недостаточно изучена. Два независимых изолята были найдены в Соединенных Штатах (Keim P. et al., 2002, 200°). Кластерная принадлежность штаммов, вызвавших на одной территории сибирскую язву у людей и животных, может сильно отличаться. Например, в Швейцарии в начале 1980-х гг. вспышки сибирской язвы среди животных вызывали штаммы В. anthracis , принадлежащие к кластеру В2, среди людей — штаммы кластера А4. Это было связано с разным происхождением источника их заражения сибирской язвой: животные инфицировались из местных очагов, а люди — во время переработки кожаного сырья, завезенного из Индии (Pilo P. et al., 2008).

Показана территориальная и временная зависимость выделения из образцов штаммов В. anthracis различных линий. 30-летнее исследование молекулярных отличий штаммов сибиреязвенного микроба, выделенных в Национальном парке Крюгера (Kruger National Park, ЮАР), позволило установить ряд любопытных закономерностей (рис. 3.4).

Рис. 3.4. Временные и территориальные зависимости выделения образцов В. anthracis в национальном парке Крюгера поданным MLVA-анализа. А. Локализация изолятов А- и В-линий: а — карта отбора индивидуальных изолятов; б — карта распределения изолятов по линиям. Б. Распределение линий изолятов по годам. В скобках количество изолятов в абсолютных цифрах. В. Связь линий изолятов с pH почвы (I) и наличием в ней солей кальция (II). По К. L. Smith et al. (2000)