Коллектив авторов: Теоретические основы и практическое применение методов иммуногистохимии

В общем случае способность антигена стимулировать продукцию антител зависит от ряда факторов. Так, с повышением молекулярной массы полимерных молекул повышается их иммуногенность. Для белков пороговый размер молекулы, определяющий появление иммуногенности, – 7 – 10 аминокислот. Это количество аминокислот, позволяющее сформировать α-спираль. Кроме этого, иммуногенность растет с повышением количества повторяющихся антигенных детерминант в составе антигена и зависит от жесткости структуры антигена, т. е. способности сохранять определенную структуру. Иммуногенность одного и того же антигена зависит от генотипа и может различаться у индивидуумов, имеющих разные отдельные варианты генов главного комплекса системы гистосовместимости, поэтому обычно одновременно иммунизируют нескольких животных (Фримел Г. М., 1987).

Слабоиммуногенные антигены необходимо вводить со стимуляторами иммуногенеза (адъювантами). Наиболее часто используют адъювант Фрейнда, в состав которого входят смесь минеральных масел, эмульгатор и убитые микобактерии. Использование в иммунизации адъюванта снижает возможность появления толерантности, позволяет расширить диапазон концентраций вводимого иммуногена от 50 до 200 мкг на одну инъекцию. Однако после введения адъюванта у животных часто образуются гранулемы, которые влияют на самочувствие, поэтому в течение иммунизации необходимо тщательно наблюдать за состоянием здоровья животного.

В ходе первичного иммунного ответа обычно образуются иммуноглобулины класса IgM, продукция которых сменяется синтезом иммуноглобулинов других изотипов. Получаемые описанным выше способом антитела в большей части относятся к IgG-фракции иммунной сыворотки. Однако ответ на некоторые антигены ограничивается синтезом IgM-антител (Haunghton G. [et al.], 1993).

В сывороточных средах содержание антител не превышает 10 % общего количества белка, поэтому для удаления примесных белков и ДНК необходимы высокоэффективные методы очистки. Для очистки антител применяется фракционирование сульфатом аммония. Последующая ионообменная хроматография обеспечивает чистоту антител на уровне только 90 %, поэтому для дальнейшей очистки необходимо использовать дополнительные методы, например гель-фильтрацию. В настоящее время большее распространение получил метод очистки антител с помощью аффинной хроматографии на иммобилизованном белке А или белке G. Этот метод очистки более быстрый (одностадийный) и позволяет получать антитела с чистотой более 95 %.

Моноклональные антитела получают с помощью метода гибридомной технологии. Гибридомы – это клоны – продуценты моноклональных антител. Для их получения лабораторные животные подвергаются иммунизации, затем из их селезенки выделяют иммунные В-лимфоциты (клетки, способные к продукции специфических клонов антител). Их соединяют с клетками миеломы (соматическая гибридизация), которые сами не могут производить специфические антитела, но способны к неограниченному размножению in vitro . После слияния клетки в течение 10 – 14 дней поддерживают в среде. Поскольку не все находящиеся в культуре клетки образованы путем слияния миеломных клеток с лимфоцитами, производящими нужные антитела, клетки, которые находятся в среде, делят на линии, которые культивируют в отдельных ячейках. Далее в культуральной среде определяют антитела и отбраковывают клеточные линии, не производящие антитела или недостаточно быстро размножающиеся. Отобранные клетки вводят в брюшную полость мышей, где гибридома размножается, подобно раковым клеткам материнской миеломы, секретируя антитела во внутриполостную жидкость с образованием асцита (скопление жидкости в брюшной полости). Асцитная жидкость содержит гомогенные моноклональные антитела в высокой концентрации (1 – 10 мг/мл) (Кеннет Р. Г. [и др.], 1983; Альтшулер E. П. [и др.], 2010).

Существуют методы получения антител и без использования лабораторных животных. Один из них основан на иммобилизации и включении клеток в твердую матрицу. Второй представляет собой культивирование клеток в гомогенной суспензии. Затруднения в использовании данных технологий возникают в тех случаях, когда иммунизация животных по какой-либо причине невозможна или не удается обойти толерантность к антигену. Для разрешения этой проблемы предложены методы молекулярного клонирования фрагментов генов антител. Одним из таких методов является техника фагового дисплея антител.