Коллектив авторов: Теоретические основы и практическое применение методов иммуногистохимии

В основе любой иммунологической реакции лежит взаимодействие антигена с антителом, которое приводит к формированию комплекса «антиген – антитело». Антигенами обычно являются высокомолекулярные белки и полисахариды, реже – полипептиды, липиды и нуклеиновые кислоты. Иммунный ответ могут вызывать и небольшие молекулы, или гаптены, в том случае если они соединяются с высокомолекулярными носителями (белками, полисахаридами). В качестве гаптенов могут выступать лекарственные вещества, моно- и полисахариды, небольшие полипептиды, фосфолипиды, триглицериды, моноамины.

Небольшой участок антигена, с которым будет связываться антитело, называется эпитопом. Обычно в эпитоп входит от одной до шести молекул моносахаридов или аминокислот, расположенных на поверхности антигена. Антитела распознают не отдельные химические группы в структуре антигена, а пространственную форму эпитопов. Они способны улавливать различия в распределении зарядов на поверхности антигена, оптическую и стереоизомерию, минимальные различия в первичной структуре. Вследствие этого б|ольшая часть антител способна связываться только с нативными антигенами или с фрагментами антигена, сохраняющими третичную структуру. Следовательно, для успешного взаимодействия антигена и антитела эпитоп должен находиться на поверхности молекулы. Следует учитывать, что при денатурации молекул (например, под действием фиксирующих жидкостей, экстремальных значений pH буферных растворов и др.) эпитоп может повышать или понижать свою иммуногенность.

Большие молекулы (например, белки) имеют несколько эпитопов, поэтому они стимулируют образование антител нескольких видов к разным эпитопам одного и того же антигена. Такие антитела называют поликлональными. Они более толерантны к незначительным конформационным изменениям антигена (полиморфизму, различной степени гликозилирования, фосфорилирования, частичной денатурации), что дает больше возможностей экспериментатору при планировании исследований.

Антитела, реагирующие с одним единственным эпитопом, называют моноклональными. В отличие от поликлональных антител, они чувствительны даже к небольшим конформационным изменениям антигена. Например, можно получить моноклональные антитела, узнающие молекулу белка, фосфорилированную по определенному сайту. Благодаря высокой специфичности моноклональные антитела являются отличными первичными антителами, то есть антителами для выявления искомого антигена, так как они дают слабое неспецифическое связывание, а значит, и меньшее фоновое окрашивание. По сравнению с поликлональными антителами они обладают большей гомогенностью, что обеспечивает высокую воспроизводимость результатов. Однако связывание с единственным эпитопом обусловливает низкую чувствительность, проявляющуюся в слабом иммуноокрашивании на срезах. К тому же высока вероятность того, что фиксатор сделает этот единственный эпитоп недоступным для антител, в результате чего иммуноокрашивания вообще не произойдет. Кроме того, методы получения моноклональных антител более сложные и трудоемкие, чем методы получения поликлональных иммунных сывороток, что приводит к значительному увеличению их стоимости.

До недавнего времени большинство моноклональных антител являлись иммуноглобулинами мыши. Поэтому в исследовательской практике работы с лабораторными животными (мышами и крысами) применять их было неудобно из-за перекрестного взаимодействия вторичных реагентов с собственными иммуноглобулинами животного. За последние несколько лет появилось много новых моноклональных антител, являющихся кроличьими иммуноглобулинами (например, клоны SP от Spring Bioscience). Считается, что кроличьи моноклональные антитела позволяют добиться лучшей визуализации антигена по сравнению с мышиными. По крайней мере, у кроличьих моноклональных антител имеется очевидное преимущество: их удобно выявлять стандартными вторичными реагентами при проведении исследований с использованием мышей и крыс в качестве лабораторных животных.

Поликлональные антитела получают путем иммунизации лабораторных животных. Обычно для этих целей используют кроликов, морских свинок или коз. Важно соблюдать принцип чужеродности иммуногена. Установлено, что чем сильнее антиген отличается по своей структуре от гомологичного антигена иммунизируемого животного, тем выше его иммуногенность. Например, инсулины человека и кролика имеют близкую первичную структуру, и поэтому для кролика инсулин человека малоиммуногенен. Между инсулином человека и морской свинки имеются достаточные отличия, что позволяет использовать этих животных как продуцентов соответствующих антисывороток (Фримел Г. М., 1987; Herschowitz H. I. D., 1985).