Елена Клещенко - ДНК и её человек [litres]

Единственным человеком, кроме Фалуны, который разделял энтузиазм Кэри Муллиса летом 1983 г., был Рон Кук, основатель компании Biosearch – той самой, которая вывела на рынок первую коммерчески успешную машину для синтеза ДНК. Может, потому, что это было хорошо для его бизнеса, или потому, что он был рациональным химиком с неповрежденным мозгом, саркастически замечал Муллис в своей Нобелевской лекции. Именно Кук посоветовал ему, коль скоро никто в Cetus не принимает его идею всерьез, не делиться с нанимателями результатом, который не связан напрямую с его обязанностями, а самостоятельно довести ее до ума и самому запатентовать. Но Муллис сомневался, что это возможно, и ответил, что ему нравится Cetus и что компания его, конечно же, не обидит, если идея принесет прибыль.

В сентябре Кэри поставил первый опыт с геном фактора роста нервов: добавил в пробирку с человеческой ДНК праймеры и полимеразу и оставил ее на 12 часов. Но когда он провел электрофорез, никакой полосы, соответствующей фрагменту длиной 400 нуклеотидов, не появилось.

Пришлось признать, что реакция не будет совсем уж простой. Дело в том, что двунитевая ДНК распадается на две свободные нити при определенной температуре (94–95° С), а комплементарные нити слипаются, подобно половинкам застежки-молнии, при низкой (желательно не выше 68° С). Для описания этих процессов молекулярные биологи заимствовали термины из металлургии, двунитевая ДНК у них “плавится”, коротенькие праймеры “отжигаются” на свободную нить [29] У металлургов отжиг – нагревание металла с последующим охлаждением, изменяющее его структуру и свойства. – Прим. ред. .

Конечно, живая клетка не должна нагреваться и остывать каждый раз, как захочет копировать свою ДНК, – в клетке расплетание и заплетание двойной спирали обеспечивают специальные белки. Но в пробирке проще действовать чистой физикой, чем добавлять все эти белки.

Соответственно, цикл усложняется: нагреть раствор с образцом ДНК – добавить праймеры – охладить пробирку – добавить ДНК-полимеразу – провести реакцию – нагреть пробирку – охладить пробирку и добавить новую полимеразу, потому что старая сварилась при нагреве и потеряла активность – провести реакцию… Чуть больше возни, но ради великой цели можно и повозиться.

В 1986 г. Рэндалл Сайки из Cetus придумал использовать для ПЦР термостабильную Taq-полимеразу. Это фермент бактерии Thermus aquaticus (от ее первых букв образовано название фермента), которая была обнаружена в горячих источниках Йеллоустонского парка; она вполне комфортно себя чувствует при температуре 70–80 °C. Белки этой бактерии, в том числе, конечно, и ее ДНК-полимераза, при температурах ПЦР не инактивируются, так что от мороки с добавлением фермента в каждом цикле научные сотрудники избавились. Помню, как на немецкой биотехнологической конференции участникам дарили значки с надписью “Guten Taq!”.

В этот момент отношения Кэри и Дженнифер окончательно испортились, и научные успехи его мало радовали. Первый удачный эксперимент состоялся лишь 16 декабря 1983 г. На этот раз Муллис поставил себе более скромную задачу: амплифицировать определенный участок плазмиды pBR322, привычного инструмента молекулярщиков. И все получилось.

В 1985 г., отшлифовав метод, Муллис отправил статью о нем в Nature . Этой статье не так повезло, как той его дебютной, про обратное течение времени, – она не была опубликована. Рецензенты нашли ее чисто технической и неоригинальной. Публикация в Science состоялась, хотя и не с первого захода. Было даже так: в 1985 г. вышла статья сотрудников Cetus, с Муллисом в середине списка соавторов, о применении ПЦР для исследования гена бета-глобина на предмет поиска мутаций, приводящих к серповидноклеточной анемии [30] Saiki R. et al. Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia // Science. 1985, 230 (4732): 1350–1354. doi: 10.1126/science.2999980. . Статья собственно про ПЦР – про ПЦР как метод амплификации ДНК – увидела свет в 1988 г. [31] Saiki R. et al. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase // Science . 1988); 239 (4839): 487–491; doi: 10.1126/science.2448875.

К тому времени полимеразная реакция уже вышла в публичное пространство – после того, как у Муллиса появилась возможность представить ПЦР на майском симпозиуме 1986 г. в знаменитой лаборатории Колд-Спринг-Харбор. Реакция научного сообщества была быстрой и впечатляющей. Cetus начала получать множество запросов о PCR, это заставило руководство внимательнее присмотреться к выдумкам Муллиса и изучить возможности дальнейшего развития технологии. Компания позволила автору посвятить все время совершенствованию ПЦР и, когда он добился успеха, наградила его беспрецедентно большим бонусом в $10 000. Позднее Cetus продала патент на ПЦР за $330 млн компании Hoffmann-La Roche. Говорили ему умные люди… Правда, сама Cetus примерно в то же время прекратила существование, в июле 1991 г. было объявлено о ее слиянии с биотехнологической компанией Chiron. Юридическая часть истории на этом не заканчивается, там еще много интересного [32] Fore J., Wiechers I. R., Cook-Deegan R. The effects of business practices, licensing, and intellectual property on development and dissemination of the polymerase chain reaction: case study // J Biomed Discov Collab . 2006; 1: 7; doi: 10.1186/1747–5333–1–7. . Права на метод в итоге принадлежат Hoffmann-La Roche и ее “дочке” Roche Molecular Systems, у них более тысячи патентов и заявок, так или иначе связанных с ПЦР.