Елена Клещенко - ДНК и её человек [litres]

Вот такое у ПЦР граничное условие: знать фланкирующие последовательности, то есть конец и начало интересующего участка. И в конце ХХ в., когда читали геном человека, фрагменты клонировали в векторах (сотрудники Крейга Вентера, которые работали с короткими фрагментами, – даже в обычных бактериальных плазмидах). А к последовательностям в векторе уже можно применять ПЦР: даже если вставку никто еще не читал, последовательность плазмиды, в которую она вставлена, известна.

С другой стороны, по мере того как развивается геномика (так назвали раздел науки, которая изучает уже не только отдельные гены, но целые геномы), нечитанных последовательностей в природе все меньше. Теперь ПЦР нашла применение и в палеогеномике. Если мы знаем, какому зверю (или человеку, брату Homo sapiens) принадлежит ископаемая кость, можно синтезировать праймеры, основываясь на геноме родственного вида.

И даже если мы этого не знаем – все равно можно попробовать. Гены, кодирующие рибосомную РНК, имеются у всего живого, при этом эволюция вносит в них изменения крайне осторожно и деликатно. Рибосомы – те самые штуки, которые синтезируют белки, и слишком смелые инновации в рибосомных генах могут привести к потере этой крайне необходимой для жизни способности. Поэтому можно вытянуть с помощью ПЦР рибосомный ген неизвестного существа и, сравнив его с известными последовательностями других существ, сделать довольно точные выводы о том, на какой веточке эволюционного древа сидел тот, кому принадлежала кость.

Полимеразная цепная реакция позволяет “снимать копии” с крайне малого количества ДНК – сотен, а то и десятков пикограммов, то есть геномов горсточки клеток. Из считанных молекул, содержащихся в образце, можно получить количество, достаточное для анализа. Теперь уликой в уголовном деле может стать и капля крови, и несколько волосков (с волосяными луковицами), а личность убитого можно установить даже по фрагменту кости.

Сегодня существует множество вариантов ПЦР для самых разных надобностей [39] 12 методов в картинках: полимеразная цепная реакция // Биомолекула . https://biomolecula.ru/articles/metody-v-kartinkakh-polimeraznaia-tsepnaia-reaktsiia . . Можно проводить реакцию с несколькими парами праймеров в одной пробирке, можно амплифицировать фрагменты длиннее 5000 пар нуклеотидов. Хитроумный способ, включающий нарезание исходной ДНК на куски и их закольцовывание, позволяет получить копии последовательности, которая в линейной ДНК была справа и слева от известных праймеров, а не между ними (это нужно, например, чтобы понять, в какое место человеческой ДНК встроил свой геном вирус). Можно запустить полимеразную реакцию внутри целых живых клеток в культуре, а потом с помощью гибридизации показать, где находится искомая нуклеотидная последовательность… Много чего можно. В настоящее время ПЦР – трудолюбивая рабочая лошадка молекулярной биологии, ее гоняют и в хвост и в гриву. Кстати, и большинство методов высокопроизводительного секвенирования с необходимостью включают в себя полимеразную цепную реакцию на этапе подготовки библиотек ДНК-фрагментов. И так будет по крайней мере до тех пор, пока не победят методы, работающие с единичными молекулами, вроде нанопорового секвенирования. То есть еще долго. Нельзя исключать, что на смену классической ПЦР придут другие методы амплификации ДНК – но и они, скорее всего, будут так или иначе использовать принцип, придуманный майской ночью на трассе 128.

Теперь опять вернемся к человеческой ДНК, Алеку Джеффрису, криминалистике и определению отцовства. Те самые участки с повторяющимися последовательностями, которые Алек Джеффрис в своих первых экспериментах искал среди рестрикционных фрагментов, мы легко можем получить с помощью ПЦР. И на форезе тогда будет не “всеобщая смазь”, какую мы видели в первых опытах, а четкие отдельные полоски.

Мы помним, что одна из самых серьезных проблем ДНК-фингерпринта в криминалистике – малые количества доступной ДНК и высокая вероятность ее деградации в неидеальных условиях места преступления. Эти проблемы помогла решить, во-первых, полимеразная цепная реакция, а во-вторых, выбор других маркеров. Вместо гипервариабельных минисателлитов (VNTR) начали использовать микросателлиты, они же короткие (простые) тандемные повторы, они же STR (short tandem repeat, simple tandem repeat). И по сей день ученые и криминалисты всех цивилизованных стран пользуются стандартными методиками для исследования STR-локусов.