Коллектив авторов - Теоретические основы и практическое применение методов иммуногистохимии

Долгое время эта ситуация создавала неразрешимую проблему для использования в иммуногистохимической диагностике материала, фиксированного в формалине и залитого в парафин – стандартный патологоанатомический материал. При необходимости иммуногистохимического исследования приходилось использовать замороженный нефиксированный материал или методы мягкой фиксации (холодный ацетон и др.). В настоящее время решение найдено. Восстановить антигенные детерминанты, которые были изменены при взаимодействии с формальдегидом, в большинстве случаев позволяет высокотемпературная обработка срезов в водных буферных растворах (Shi S. R. [et al.], 1991). Этот метод получил название «тепловое демаскирование антигенов». В англоязычной литературе он обычно называется heat-induced epitope retrieval. Следует отметить, что теоретические основы этого метода пока не разработаны. До сих пор непонятно, почему обработка материала при температуре свыше 100 °C приводит к восстановлению антигенных свойств белков, а не к их денатурации и дальнейшему разрушению антигенных детерминант. Тем не менее многочисленные исследования показывают высокую эффективность процедуры теплового демаскирования (Taylor C. R. [et al.], 1996; Evers P. [et al.], 1998; Kоржевский Д. Э. [и др.], 2005; Сухорукова Е. Г. [и др.], 2012). Причем метод оказался пригоден не только для парафиновых срезов, но и для материала, залитого в целлоидин (Shi S. R. [et al.], 1992a; 1992b; 1993), и даже для срезов, полученных с блоков, залитых в эпоксидные смолы.

В настоящее время разработано множество модификаций способа теплового демаскирования антигенов. Общим для них является прогрев срезов, приклеенных к предметным стеклам, в водных растворах до температуры 95 – 100 °C, а в отдельных случаях – и до 120 °C при повышенном давлении.

С учетом эмпирически установленных особенностей процесса демаскирования в качестве растворов могут быть использованы водные растворы солей различных металлов и буферные растворы при различных pH. Считается, что, помимо гидролиза межмолекулярных связей, образованных благодаря действию фиксаторов, эффективность теплового демаскирования зависит от полноты удаления из срезов ионов кальция. Это достигается введением в буферные растворы солей лимонной кислоты или этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА, Трилон Б).

Для теплового демаскирования антигенов разработано множество рецептов буферных растворов. В большинстве случаев (если только нет указаний о непригодности этого раствора в аннотации к конкретным антителам) можно применять цитратный буфер (рН = 6,0). По мнению D. J. Dabbs (2006), при отсутствии специального буфера можно использовать дистиллированную воду без добавок. Эффективность демаскирования антигенов в дистиллированной воде ниже, чем при использовании специальных буферных растворов. Наш опыт свидетельствует о том, что при демаскировании антигенов в дистиллированной воде развивается неспецифическое фоновое окрашивание срезов, которое мешает идентификации иммунореактивных структур. Учитывая простоту приготовления цитратного буфера, в общих случаях для демаскирования лучше использовать именно этот раствор.

Как правило, производители первичных антител указывают на необходимость проведения теплового демаскирования для материала, фиксированного в формалине и залитого в парафин, то отмечают, в каком буфере следует производить демаскирование. Наибольшее распространение получили три буферных раствора, применяемых для демаскирования в том случае, когда оно действительно необходимо. Кроме упомянутого цитратного буфера (рН = 6,0), это EDTA-буфер (pH = 8,0) и Tris-EDTA (pH ≈ 10,0). Ряд производителей антител рекомендует для обработки свои оригинальные буферные растворы (например, S-1700 (Dako), CC1 и CC2 (Roche-Ventana), Bull’s Eye Decloaker (Biocare) и др. ). В отдельных случаях эти растворы позволяют добиться лучшего демаскирующего эффекта, чем обычный цитратный буфер (pH = 6,0). Судя по литературе, среди коммерческих буферных растворов наибольшей популярностью у специалистов пользуется модифицированный цитратный буфер с pH = 6,1 (S-1700, Dako).

Одним из недавних усовершенствований технологии теплового демаскирования антигенов является объединение этого этапа обработки препарата с депарафинированием срезов. При этом используются водные растворы детергентов, а не ксилол и аналогичные органические растворители парафина. При прогреве срезов в водных растворах до температуры, близкой к 100 °C, парафин, имеющий сравнительно низкую температуру плавления, уже расплавлен. Трудность заключается в том, чтобы эффективно удалить расплавленный парафин из среза. Для этого в демаскирующий раствор вводятся детергенты. При обработке таким раствором образуется эмульсия парафина в демаскирующем растворе и, соответственно, происходит депарафинирование среза без применения органических растворителей. Наиболее известным коммерческим буферным раствором для одновременного удаления парафина и теплового демаскирования антигенов является раствор Trilogy (CellMarque, США). Метод одновременного удаления парафина и теплового демаскирования антигенов используется в автоматической системе иммуноокрашивания BenchMark (Ventana, США).