Ирина Спивак - Экология. Повреждение и репарация ДНК - учебное пособие

Что же играет главную роль в распознавании корректирующей активностью ДНК-полимеразы неправильно подставленного нуклеотида? Каким образом отделить в эксперименте фактор энергетический (необходимость образования водородных связей между двумя спаривающимися нуклеотидами) и фактор геометрический (необходимость правильной стереометрической формы образовавшейся пары)? Это в 1997 году удалось сделать Кулу с соавторами. Они использовали в качестве аналога тимина неполярный дифтортолуол (F) и соответствующий ему dFTP, который в полимеразной реакции подобен dTTP, но только стерически, так как совершенно не способен образовывать водородные связи. Удивительно, но частота ошибочного включения дифтортолуола напротив аденина оказалась на три порядка выше, чем частота такого же неправильного (вместо тимина) включения цитозина. То есть ДНК-полимераза предпочитает встраивать неспособный к образованию водородных связей, но более близкий к тимину стерически, фтортолуол, а не цитозин, способный к образованию водородных связей, но не столь идентичный тимину стерически. Таким образом, хотя это и выглядит почти фантастически, ДНК-полимеразы способны включать в синтезируемую нить любую органическую молекулу (представленную, естественно, в форме дезокситрифосфата), лишь бы она соответствовала структурным требованиям активного центра самого фермента и В-формы ДНК.

Корректирующая экзонуклеазная активность не обязательно является частью процессивной ДНК-полимеразы. Достаточно часто в клетке для коррекции новосинтезированной ДНК привлекаются многочисленные автономные экзонуклеазы. Эти экзонуклеазы способны отщеплять неправильный нуклеотид, образуя (или не образуя) комплекс с ДНК-полимеразами.

При синтезе ведущей нити основную роль играют ДНК-полимераза III Е. coli, ошибочность которой составляет 10 -6, а у эукариот ДНК-полимеразы ε и δ (ошибочность 10 -5). Различные автономные экзонуклеазы способны повышать точность этих процессивных полимераз в 5-10 раз.

При синтезе отстающей нити у Е. соli в объединении фрагментов Оказаки участвует ДНК-полимераза I. Точность этой умеренно процессивной полимеразы резко увеличивается в присутствии автономных экзонуклеаз.

Большинство систем репарации ДНК нуждаются в синтезе ДНК при исправлении ошибок. У Е. соli в репарации ДНК существенное участие принимает ДНК-полимераза I, точность работы которой явно увеличивается в присутствии автономных экзонуклеаз. В клетке человека за сутки образуется в среднем 10 5спонтанных повреждений ДНК в результате ее дезаминирования, депуринизации, окисления и неправильного метилирования. Большинство этих повреждений репарируются при участии ДНК-полимеразы β (ошибочность 10 -3), В результате этого в транскрибируемой ДНК каждый раунд репликации появляются приблизительно 3 ошибки, подлежащие коррекции. При работе другой системы репарации непроцессивные безнуклеазные сверхошибочные (ошибочность 10 -2) ДНК-полимеразы ведут синтез ДНК в обход повреждений в ДНК-матрице. После завершения синтеза на поврежденной матрице они должны быть заменены, по-видимому, с помощью репликативного фактора С, на основную элонгирующую ДНК-полимеразу δ (ошибочность 10 -5). Но в силу той же инерционности биохимических реакций замена не происходит мгновенно, что требует исправления ошибок (совершенных непроцессивными полимеразами напротив неповрежденной матрицы), в том числе с участием автономных экзонуклеаз. В экстрактах клеток человека недавно показана экзонуклеазная коррекция ошибок, допущенных сверхошибочной ДНК-полимеразой η (эта). Наконец, автономные экзонуклеазы участвуют в коррекции гетеродуплексов.

Все виды экзонуклеазной коррекции должны закончиться за время данной репликации. По-видимому, коррекция ДНК-полимеразных ошибок – весьма эффективный процесс, поскольку анализ генома человека показал, что дивергенция последовательностей в транскрибируемой ДНК составляет примерно 0,1 % при исследовании ДНК от 24 человек различных этнических групп.

Большинство повреждений ДНК не являются результатом только ошибок репликации. Множество повреждений возникает в любое время клеточного цикла под действием как экзогенных, так и эндогенных факторов. В табл. 1. схематично изображены основные типы повреждений ДНК, которые опознаются и устраняются различными системами репарации.