Ирина Спивак - Экология. Повреждение и репарация ДНК - учебное пособие

Частота ошибочных встроек нуклеотидов в ходе репликации у бактерий составляет приблизительно 10 -7-10 -11. При этом известно, что ДНК-полимераза, синтезируя новую цепь, делает ошибки примерно в 100 раз чаще. Подобное увеличение точности репликации связано с тем, что одновременно ДНК-полимераза способна производить проверку встраивания. Большинство прокариотических, а также и эукариотических, полимераз в дополнение к полимеризующей активности в направлении 5'→3' имеет экзонуклеазную активность в направлении 3'→5'. При встраивании «неправильного» нуклеотида ошибка обычно (хотя и не всегда) распознается самой полимеразой, вероятно, из-за того, что в этом месте в двойной спирали образуется пузырь или впячивание, наличие которых не позволят полимеразе добавить следующий нуклеотид к растущему З'-ОН-концу. Процесс репликации не пойдет дальше до тех пор, пока «неправильный» нуклеотид не будет удален, а нужный не встанет на его место. У ДНК-полимеразы III E.coli эндонуклеазной активностью обладает субъединица ε (эпсилон), которая кодируется геном mutD, при инактивации которого возникают клетки с мутаторным фенотипом. Именно эта субъединица повышает точность ДНК-полимеразы III на 2–3 порядка. При мутациях гена mutD возникает дефект в системе проверки правильности встраивания нуклеотидов в направлении 3'→5'. В результате многие из неправильно встроенных нуклеотидов остаются во вновь синтезированной нити ДНК и с той или иной вероятностью приводят к возникновению мутаций.

Корректирующая 3'-5'-экзонуклеазная активность ДНК-полимеразы сама по себе является достаточно сложным и энергоемким процессом. При расчистке участка ДНК с неправильно спаренным основанием поисходит следующая цепь событий. Связывание dNTP с комплексом «ДНК-полимераза-матрица-З'-конец синтезируемой нити» протекает, как минимум, через два конформационных изменения ДНК-полимеразы. При попадании неправильного dNTP в реакцию оба эти конформационные изменения замедляются, что способствует перемещению неправильного конца в активный центр 3'-5'-экзонуклеазы (субъединицы ε) для расчистки участка ДНК вокруг неспаренного основания и его последующего ресинтеза. Так как биохимические реакции обладают некоторой инерционностью, в ходе расчистки удаляются не только неправильные, но и расположенные по соседству правильные нуклеотиды. Таким образом корректирующая активность ДНК-полимеразы не может превышать оптимальный предел, ведь в противном случае «сверхкорректная» полимеризация потребовала бы огромных затрат энергии, одновременно приводя к резкому снижению скорости синтеза ДНК. Этот предел и ограничивает повышение точности репликации примерной величиной 10 2.

Здесь нужно остановиться еще на двух моментах. Во-первых, на разных нитях ДНК корректирующая активность полимеразы проявляется в разной степени. Частота ошибок в отстающей нити всегда в 10–20 раз выше, чем в ведушей. Например, в клетке человека за раунд репликации образуется 2х10 6фрагментов Оказаки. В начале синтеза каждого из них ДНК-полимераза α (ошибочность которой 10 -4) присоединяет 30–40 dNМР к РНК-праймеру. В процессе объединения фрагментов Оказаки большая часть этих dNМР выщепляется. Если предположить, что в каждом фрагменте Оказаки остается хотя бы один dNМР, присоединенный с помощью ДНК-полимеразы α, то, учитывая, что лишь 3 % ДНК млекопитающих транскрибируется, в транскрибируемой ДНК за раунд репликации образуется примерно 60 ошибок, подлежащих коррекции. Это является логическим объяснением того, что у эукариот ошибочность отстающей нити на порядок превышает таковую величину для лидирующей нити, где ДНК-полимераза α участвует только в инициации синтеза на ориджине репликации; один раз на весь репликон.

Во-вторых, PolIII способна корректировать преимущественно трансверсии из-за того, что пара пурин-пурин и пиримидин-пиримидин легче распознаются корректирующей активностью ДНК-полимераз, чем некомплементарные пары пурин-пиримидин. В то же время транзиции и сдвиги рамки считывания преимущественно исправляются уже после завершения репликации системой репарации неспаренных оснований (MMR, missmatch repair).

Вследствие этого транзиции происходят чаще, чем трансверcии, хотя теоретически должно быть наоборот – ведь каждый пурин может быть заменен на один пурин или на три пиримидина, а каждый пиримидин – на один пиримидин или два пурина.