Коллектив авторов - Морфологическая диагностика. Подготовка материала для гистологического исследования и электронной микроскопии

Перед использованием этанола следует убедиться в том, что содержание в нем воды соответствует допустимому уровню для соответствующих методов фиксации и дальнейшей обработки материала. Содержание воды проверяют ареометром (спиртометром). При этом важно соблюдать рабочую температуру, указанную на спиртометре.

Обычно для фиксации употребляется безводный, так называемый абсолютный спирт. Хорошие результаты фиксации удается получить в случае, если толщина объектов не превышает 5 мм. Фиксация идет очень быстро. Для очень тонких кусочков достаточно 15 – 30 мин, при толщине 1 – 2 мм – 0,5 – 1,0 ч, при толщине 3 – 4 мм – 2 – 4 ч. Важно, чтобы препараты лежали на толстом слое ваты в большом количестве спирта, а спирт не разбавлялся проникающей из препарата водой, которая при соблюдении указанных условий будет опускаться на дно. Слой ваты создает условия для равномерной фиксации, благодаря которым спирт проникает в препарат со всех сторон.

Действию абсолютного спирта препарат подвергают в течение времени, необходимого для его полного пропитывания. Длительное воздействие абсолютного этанола чрезмерно уплотняет ткани и делает их хрупкими. Плохо пропитывающиеся объекты (особенно ткани беспозвоночных) Б. Ромейс (1954) рекомендует фиксировать в кипящем абсолютном спирте (2 – 10 мин).

Сразу же после окончания фиксации зафиксированные кусочки лучше пропитать и залить (в парафин, целлоидин либо другие среды). Если нет возможности сразу залить фиксированный препарат, то он переносится в терпинеол или 80 %-й этанол, в которых материал может длительно сохраняться без нарушения способности к окраске и резке (Ромейс Б., 1954).

Артефактами спиртовой фиксации являются сильное сморщивание клеток и смещение клеточного и ядерного содержимого, а иногда и самих ядер к середине кусочка (по направлению проникновения фиксатора в объект).

Сочетание этанола с другими фиксирующими веществами часто используется в научных исследованиях, поскольку позволяет в значительной мере уменьшить отрицательные свойства индивидуальных фиксирующих агентов и ускорить процесс фиксации и последующей проводки, так как в спиртовых растворах одновременно с процессом фиксации начинается обезвоживание тканей.

Сочетание этанола с формальдегидом . Существует несколько вариантов прописи фиксатора, состоящего из этанола и формалина (или параформальдегида). Чаще всего используют 5 – 10 %-й раствор формалина на основе спирта различной крепости (от 70 %-го до абсолютного). Для иммуноцитохимических исследований рекомендуется использовать 1 – 2 %-й раствор формалина (или 0,5 – 0,7 %-й раствор параформальдегида) на 80 %-м этаноле.

Для приготовления 100 мл фиксатора берут 98 мл 80 %-го этанола и 2 мл концентрированного формальдегида. Если используется сухой параформальдегид, фиксатор удобнее готовить следующим образом. Заранее готовится 4,0 %-й водный раствор параформальдегида, который может длительно сохраняться. Для этого параформальдегид растворяют в дистиллированной воде при нагревании (проще всего закрытую емкость оставить в термостате при 37 или 56 °C на 1 – 3 сут, несколько раз перемешивая раствор в течение дня). На каждые 80 мл 96 %-го этанола добавляют по 15 мл полученного водного раствора параформальдегида.

Продолжительность фиксации для иммуноцитохимии – 18 – 24 ч, для обычных окрасок – до 48 ч при комнатной температуре. После фиксации материал в воде не промывают. Обезвоживание можно начинать с 90 – 96 %-го спирта (Коржевский Д. Э. [и др.], 2010).

Абсолютный спирт с добавлением ледяной уксусной кислоты (например, 20 мл кислоты на 100 мл спирта) быстро проникает в ткани, так что в нем могут профиксироваться за несколько часов и кусочки несколько более крупные, чем в абсолютном спирте. Способ употребления и результаты сходны с теми, которые характерны при использовании абсолютного спирта. После фиксации материал переносят еще на короткий срок в чистый абсолютный спирт. Затем следует заливка (Ромейс Б., 1954).

Жидкость Карнуа . Эта фиксирующая жидкость хорошо сохраняет структуру ядра клетки и часто применяется при необходимости быстрой фиксации и ускоренной проводки. Фиксатор готовится менее чем за 1 ч до начала фиксации. Фиксатор состоит из абсолютного спирта (можно заменить и 96 %-м), хлороформа и ледяной уксусной кислоты в соотношениях 6: 3: 1. При фиксации в жидкости Карнуа следует вырезать кусочки толщиной не более 4 мм. Продолжительность фиксации составляет 3 – 4 ч. Длительное пребывание объектов в фиксаторе в большинстве случаев нежелательно. После жидкости Карнуа материал обезвоживают в абсолютном этаноле, после чего можно сразу приступать к заливке. В случае необходимости после фиксации и обезвоживания материал можно длительно хранить в метилсалицилате (Коржевский Д. Э. [и др.], 2010).