Коллектив авторов - Морфологическая диагностика. Подготовка материала для гистологического исследования и электронной микроскопии

Редактор руководства приносит сердечную благодарность своим учителям – доценту Людмиле Ростиславовне Сапожниковой, профессору Георгию Сильвестровичу Катинасу и члену-корреспонденту РАМН Владимиру Александровичу Отеллину.

Авторы надеются, что представленные в книге прописи и протоколы, а также сведения о производителях высококачественных реагентов, материалов и приборов для микроскопии и диагностики помогут всем, кто планирует использовать в своей повседневной работе и научных исследованиях современные методы гистологии, цитологии и электронной микроскопии.

Фиксация– один из ключевых этапов гистологического исследования, от которого во многом зависит качество получаемого препарата. Фиксированный не по правилам или недофиксированный препарат, как правило, непригоден для микроскопического анализа, поэтому необходимо тщательно соблюдать правила фиксации и регулярно контролировать качество реагентов, используемых для приготовления фиксирующих растворов.

Фиксация обеспечивает стабилизацию и уплотнение тканевых структур. Выбор фиксирующей среды зависит от задач исследования. Объем фиксирующей жидкости должен превышать объем кусочков не менее чем в 10 раз. Кусочки в растворе не должны слипаться и скапливаться на дне банки. В большинстве случаев (если нет особых указаний) фиксацию следует проводить при комнатной температуре, поскольку охлаждение раствора ведет к замедлению процесса фиксации, а подогрев – к быстрому развитию аутолиза в центральной части фиксируемого объекта (той области, в которую не успел проникнуть фиксатор).

Важным моментом является правильное иссечение объектов, предназначенных для фиксации и дальнейшего гистологического исследования. Кусочки органов следует вырезать острым ножом или бритвой. Не рекомендуется пользоваться ножницами во избежание травмирования объектов. Нельзя сдавливать кусочки, скоблить или протирать их поверхность, особенно слизистую и серозную оболочки.

Для микроскопического исследования вырезают кусочки органов толщиной 0,5 – 1,0 см. Длина и ширина могут быть различными (обычно 1,0 × 1,5 см). При этом стараются сформировать объект с таким расчетом, чтобы получаемый срез поместился на стандартное предметное стекло. Ввиду медленного проникновения фиксатора в глубину ткани не рекомендуется брать для исследования более толстые кусочки. Кусочки сразу же помещают в фиксирующую жидкость. Недопустимо обмывание кусочков водой перед фиксацией (это может привести к удалению объектов, имеющих диагностическое значение, и появлению артефактов).

Световая микроскопия– микроскопия в проходящем свете видимого спектрального диапазона с использованием способности различных компонентов гистологического препарата к селективному восприятию биологических красителей. Для того чтобы структуры, наблюдаемые в микроскоп, хорошо сохранялись при обработке иссеченного материала, необходимо сделать их устойчивыми к действию применяемых при проводке и окраске химических реагентов. Подобная устойчивость структур, а также уплотнение материала достигаются в ходе фиксации. Фиксация необходима и для максимального сохранения внутриклеточных и тканевых взаимоотношений, только при этом условии можно получить информативные препараты для диагностических и исследовательских целей.

Существуют физические и химические способы фиксации. К первым относятся действие высокой температуры и влияние электромагнитного излучения в сверхвысокочастотном диапазоне (микроволновая фиксация). В настоящее время высокотемпературная фиксация применяется редко. По С. С. Вайлю, кусочки нефиксированной ткани помещают в кипящую воду на 1 – 3 мин, после чего переносят в 90 – 100 %-й этанол и после обезвоживания заливают в парафин. Р. Лилли (1969) рекомендует использовать для варки изотонический раствор хлорида натрия (0,85 – 0,90 %) и изготавливать срезы на замораживающем микротоме без заливки. В этом случае препарат можно получить через несколько минут после доставки срочной биопсии. К возникающим артефактам относят сильное сморщивание тканей и разрушение нежных структурных образований (Вайль С. С., 1934).