А. Крылов - Регрессия как этап развития

В последний экспериментальный день после интраперитониальной инъекции алкоголя (этанола; 0,5 г/кг) животных помещали на 30 мин в экспериментальную клетку, содержащую педаль и кормушку, для обучения пищедобывательному навыку нажатия лапами на педаль. Нажатие на педаль приводило к появлению порции пищи в кормушке (кубик сыра). Данное пищевое поведение не требовало использования вибрисс как условия достижения результата (в отличие от питьевого поведения, приобретенного ранее). Видеозапись поведения осуществлялась на цифровую видеокамеру, закрепленную на верхней стороне экспериментальной клетки пищедобывательного навыка. Анализ видеозаписи поведения был осуществлен с использованием программы Easy Track, которая позволяет оценивать поведение животного в «зонах интереса». В качестве таковых было выбрано четыре зоны: зона эффективной кормушки, зона эффективной педали, зона неэффективной кормушки, зона неэффективной педали.

Через 75 минут после окончания сессии обучения пищедобывательному навыку животных усыпляли ингаляционным наркозом (эфиром), мозг извлекали и замораживали в парах жидкого азота. Животные группы пассивного контроля были взяты из домашней клетки вивария непосредственно перед извлечением мозга.

Для оценки распределения с-Fos-положительных нейронов в головном мозге были проанализированы бочонковое поле соматосенсорной коры (поскольку известно, что нейроны данной области активируются при использовании грызунами вибрисс), а также ретросплениальная кора, в которой, как нам известно (см.: Горкин, Шевченко, 1995; Александров, 2011б; Александров и др., 2015; Alexandrov et al., 1990а, 1991, 2000; Gavrilov et al., 1998; Svarnik et al., 2005), большой процент нейронов у крыс специализируется относительно пищедобывательного акта инструментального поведения – нажатия на педаль. Анализ распределения Fos-положительных нейронов проводился на фронтальных криостатных 20-микронных срезах головного мозга крыс. Срезы брались с шагом в 80 микрон на уровне 3,36–4,36 от брегмы, что позволило в дальнейшем анализировать соматосенсорную и ретросплениальную кору (Paxinos, Watson, 2009). После фиксации в 4-процентном параформальдегиде и промывки срезы предынкубировались в фосфатном буфере с добавлением 2,5-процентной нормальной сыворотки для снижения неспецифического окрашивания. Выявление индукции экспрессии с-Fos проводилось иммунногистохимически, в соответствии с протоколом стрептавидин-биотин-пироксидазного иммунногистохимического набора (Vectastain Elite ABC KIT, Vector, USA). Для реакции были использованы поликлональные кроличьи антитела к c-Fos (AB-5, Oncogene Science, USA) в разведении 1: 2000 (см.: Сварник и др., 2014). После появления окраски стекла были дегидратидированы проведением через серию спиртов восходящей концентрации и ксилол, а затем заключены под покровные стекла.

Срезы оцифровывались при 10-кратном увеличении на микроскопе Olympus V-110 с помощью высокоразрешающей CCD камеры (Nikon DMX-1200) и вводились в компьютер для анализа распределения иммунопозитивных клеток в мозге. Окрашенные клетки в исследуемых областях мозга были подсчитаны на компьютере с помощью морфометрической программы Image Pro 3.0.

В описываемых здесь экспериментах с введением алкоголя было выявлено, что при формировании второго, пищедобывательного навыка введение алкоголя «блокирует» реактивацию (по белку c-Fos) нейронов систем первого, питьевого навыка. Число Fos-положительных нейронов в контралатеральном бочонковом поле при обучении второму навыку под воздействием алкоголя оказалось достоверно меньшим, чем в ситуации без алкоголя (U Манна – Уитни, z = 2,72; p = 0,006; величина эффекта (effect size) r = 0,79) (см. рисунок 3). Кроме того, животные, находящиеся под влиянием алкоголя, были менее активны, чем животные, не находящиеся под влиянием алкоголя (U Манна – Уитни, z = 2,32, p = 0,02; величина эффекта r = 0,67), что выражалось как в снижении общей длины трека и общей длительности двигательной активности, так и в снижении средней скорости передвижения. Общий паттерн распределения нейрогенетических изменений в коре головного мозга под воздействием алкоголя и без него оказался одинаковым. Но при этом в целом под воздействием алкоголя число активированных нейронов в корковых структурах головного мозга оказалось в разы меньшим, чем без этого воздействия (U Манна – Уитни, p<0,01 для обеих проанализированных структур в обоих полушариях (на рисунке 3 обозначено звездочкой); величина эффекта r = 0,83 для ретросплениальной коры контралатерального полушария относительно используемой вибриссной подушки, r = 0,81 для ретросплениальной коры ипсилатерального полушария; r = 0,79 для бочонкового поля контралатерального полушария, r = 0,83 для бочонкового поля ипсилатерального полушария), что соответствует данным литературы (напр.: Lu et al., 2014).