Ирина Якутенко - Вирус, который сломал планету. Почему SARS-CoV-2 такой особенный и что нам с ним делать

Рис. 10.На первой стадии реакции фермент обратная транскриптаза копирует выбранный учеными фрагмент вирусного генома и одновременно переводит его с языка РНК на язык ДНК. Чтобы отграничить целевой участок, ученые используют праймеры — короткие кусочки ДНК, которые прочно прилипают к границам выбранного фрагмента. Полимераза может начать работу, только сев на «склеившуюся» пару праймер-РНК или праймер-ДНК. После того как нужный фрагмент переписан в молекулу ДНК, начинает работать другой фермент — ДНК-полимераза. Она тоже копирует лишь то, что находится между двумя праймерами. В результате образуются сдвоенные кусочки ДНК, состоящие из целевого фрагмента и праймеров. Реакция идет циклами: на каждом сначала сдвоенные кусочки разъединяют, нагревая реакционную смесь, на образующиеся одинарные нити ДНК приклеиваются свободные праймеры, полимераза садится на них и синтезирует новый одинарный кусочек, который оказывается спарен с первым. Реакцию проводят до тех пор, пока в пробирке не накопится заметное количество целевых фрагментов

Цикл, на котором появляется положительный сигнал, называется C(t) — от английского cycle threshold , то есть пороговый цикл. Приведенные выше значения C(t) 25 и 34 взяты не с потолка — это результат анализа большого количества тестов с последующим подсчетом числа копий вирусной РНК и заражением клеток [319] M. R. Tom and M. J. Mina, «To Interpret the SARS-CoV-2 Test, Consider the Cycle Threshold Value», Clin. Infect. Dis. , May 2020. . Иными словами, если положительный сигнал проявился только на C(t)=34 (плюс-минус несколько циклов, в зависимости от конкретного прибора и протокола), в данный конкретный момент тестируемый не заразен. И если у него уже проявились симптомы, то он вряд ли представляет опасность для окружающих, так как максимальное открытие «окна заразности» приходится на период около появления симптомов. Чтобы удостовериться, что первый тест не был ложноотрицательным, имеет смысл повторить анализ через 24 часа, и если C(t) снова будет в районе 34, человек почти наверняка не распространяет вирус. Если за сутки концентрация РНК в глотке не изменилась или упала, значит, организм пациента уже победил вирус либо вирус спустился в нижние дыхательные пути, откуда ему трудно добраться до других потенциальных носителей.

Если результат теста положителен с C(t) около 34, но симптомов у тестируемого нет, то либо они появятся в ближайшее время, либо этот человек относится к загадочной группе асимптоматиков, либо он уже выздоравливает, но на симптомы внимания не обратил, так как они были слабыми. Но в любом случае на момент, когда этот человек сдавал тест, он не представлял опасности для других людей. Чтобы понять, что с ним делать, опять же имеет смысл повторить тест через 24 часа и посмотреть на динамику. Если второй анализ даст положительный сигнал, скажем, на 25-м цикле — вирус активно размножается и пациент находится в опасной для окружающих фазе болезни. Если же второй результат вновь покажет C(t)=34 или вовсе будет отрицательным — пациент не заразен.

В среднем отличие C(t) в 3,3 цикла указывает на десятикратную разницу в исходной концентрации вирусных нуклеиновых кислот. Иначе говоря, в образце, который дал положительный сигнал на 25-м цикле, в 10 раз больше РНК коронавируса, чем в образце, в котором положительный сигнал проявился на 28-м цикле. Зная это и крайнее значение C(t), выше которого образец условно считается чистым, можно гораздо точнее интерпретировать положительные результаты РНК-теста. Однако такая практика не применяется для массового тестирования, и итоги генетического анализа рассматривают бинарно: либо «да», либо «нет» — очевидно, потому, что так проще при большом потоке образцов. Причем за стандартную границу, которая отделяет положительный и отрицательный результаты ПЦР-теста часто принимают C(t)=40, что, безусловно, избыточно: так как полимераза всегда работает с ошибками, да и праймеры могут иногда «прилипать» к нецелевым фрагментам, на 40-м цикле накапливается множество посторонних фрагментов, которые способны дать ложноположительный сигнал. Возможно, в будущем чиновникам от здравоохранения придется пересмотреть систему оценки результатов, в противном случае будет крайне сложно организовать массовое тестирование, которое позволило бы странам не жить в режиме вечного карантина, а вернуться к нормальному существованию. Мы подробнее обсудим этот момент в главах 11 и 12.