Наталья Стволинская - Цитология

Живые клетки бесцветны и прозрачны. Их показатель преломления близок к показателю преломления окружающего раствора. Поэтому неокрашенные клетки трудно рассматривать под микроскопом. В начале XIX в. ученые стали использовать цветные красители, которые делали клеточные структуры более контрастными и видимыми в световой микроскоп. Сейчас таких красителей множество. Некоторые из них преимущественно окрашивают определенные клеточные органеллы. Наиболее часто используемые красители для выявления общей морфологии клеток – это гематоксилин и эозин. Гематоксилин имеет сродство к отрицательно заряженным молекулам, поэтому выявляет распределение в клетках дезоксирибонуклеиновой кислоты и кислых белков. Обработка клеток гематоксилином приводит к выявлению структур ядра: хроматина, хромосом, ядрышка. Эти структуры окрашиваются в сине-фиолетовые цвета. После гематоксилина препарат помещают в раствор эозина, который окрашивает все остальные структуры клетки в розовый цвет. На розовом фоне цитоплазмы будет четко видна контрастная фиолетовая структура ядра.

Наибольшие успехи в описательной цитологии были достигнуты, когда в XIX в. научились делать постоянные, длительно хранящиеся окрашенные препараты клеток и тканей. Приготовление таких препаратов трудоемко и включает ряд этапов. Первый этап – взятие материала для исследования и фиксация небольшого кусочка ткани (0,5 см 3). Цель этого процесса – быстро законсервировать клетки, но предотвратить распад клеточных структур. Чаще всего в качестве фиксаторов для световой микроскопии используют формалин, спирт, пикриновую кислоту, смеси формальдегида с этиловым спиртом, хотя известны сложные смеси многокомпонентных фиксаторов.

После фиксации из кусочка ткани нужно приготовить тонкие срезы толщиной 5–10 мкм на специальном приборе микротоме с помощью очень острого металлического ножа (лезвия). Чтобы срезы получились тонкими, кусочек ткани после фиксации обезвоживают с применением серии спиртов повышающейся концентрации и ксилола, затем пропитывают расплавленным парафином при 56ºС. При комнатной температуре парафин застывает, и кусочек ткани становится твердым, он готов для приготовления срезов.

Приготовленные срезы помещают на предметное стекло, растворяют парафин ксилолом, постепенно замещают ксилол водной средой с помощью растворов этилового спирта убывающей концентрации. Затем препарат окрашивают в водном растворе красителя. После окрашивания препарат опять обезвоживают и заключают в каплю канадского бальзама под покровное стекло. Такой препарат может храниться очень долго, на протяжении нескольких лет.

Совокупность приемов и методов приготовления и анализа с помощью световой микроскопии называется микротехникой.

В XX в. были разработаны световые микроскопы, позволяющие более детально изучать живые неокрашенные клетки. Это интерференционная микроскопия, поляризационная микроскопия, разнообразные приставки к обычному световому микроскопу – фазово-контрастная микроскопия и метод темного поля.

При изучении живых клеток широко используется люминесцентная (флюоресцентная) микроскопия. В люминесцентном микроскопе объект освещается ультрафиолетовым лучом, используются особые красители – флюорохромы, которые при поглощении энергии света начинают ярко флюоресцировать. Флюорохромы могут избирательно связываться с определенными структурами клетки или макромолекулами. При таком микроскопировании светящиеся клеточные структуры выявляются на темном фоне. Разрешающая способность люминесцентного микроскопа такая же, как в световом.

Вопросы

1. Какой размер имеют клетки?

2. Перечислите компоненты микроскопа, задействованные в построении изображения. Какую функцию они выполняют?

3. Что такое разрешающая способность светового микроскопа?

4. Что такое микротехника?

5. Для чего используется фиксация? Приведите примеры фиксаторов.

6. Перечислите этапы приготовления постоянных препаратов.

Развитие световой микроскопии и техники приготовления препаратов позволило в тридцатых годах XIX в. сформировать представление о таких клеточных компонентах, как протоплазма и ядро. Впервые это обсуждается в работах Я. Пуркинье и Р. Броуна. Чуть позже немецкий ботаник М. Шлейден обобщил накопленные данные о сходстве строения клеток растений. Он высказал гипотезу о том, что все растения состоят из клеток, ошибочно считая, что клетки растений образуются путем кристаллизации жидкости вокруг ядра, и появление клеточной структуры растения связано с его жизнедеятельностью.