Максим Франк-Каменецкий - Самая главная молекула. От структуры ДНК к биомедицине XXI века

Как видно из рис. 44, молекулы, состоящие исключительно из последовательности-мишени, появляются только в третьем цикле. В ходе дальнейших циклов их количество растет экспоненциально. Восемь таких молекул образуется на 4-м цикле, 32 738 – на 15-м и миллиард на 30-м. В ходе своих первых опытов Мулис и его коллеги не могли делать так много циклов. Основная проблема состояла в инактивации фермента при нагревании, так что порции свежего фермента приходилось добавлять вновь и вновь в каждом цикле.

Важнейшее усовершенствование, сделавшее ПЦР столь потрясающим методом, состояло в замене ДНК-полимеразы I так называемой Taq -полимеразой. Выделенная и термофильных бактерий, живущих в горячих источниках, Taq- полимераза легко выдерживает нагревание до 94 °C. При такой температуре цепи ДНК расходятся. Taq -полимераза лучше работает в горячих условиях, так что с ее помощью реакцию удлинения праймера ведут при 72 °C.

Использование Taq -полимеразы позволяет проводить ПЦР в полностью автоматизированном режиме, используя простой робот, называемый термоциклером или ПЦР-машиной. В обычной пробирке смешивают ДНК-мишень, четыре дНТФ и Taq -полимеразу в соответствующем буфере, содержащем необходимые ионы металлов. Затем пробирку помещают в термоциклер, который программируется на изменение температуры по следующей схеме: нагрев до 94 °C и выдерживание при этой температуре 1 минуту; охлаждение до 60 °C и выдерживание при этой температуре 1 минуту (на этом этапе праймеры связываются с комплементарными участками на концах мишени); нагрев до 72 °C и выдерживание при этой температуре 1 минуту для проведения реакции удлинения праймера при оптимальной температуре для Taq -полимеразы. Затем термоциклер начинает новый цикл по той же схеме (подъем температуры до 94 °C и т. д.). Затем еще цикл и еще цикл, сколько пожелает оператор.

Одна из многих замечательных особенностей ПЦР состоит в том, что вам не нужно очищать мишень от примеси чужеродной ДНК. Праймеры строго отберут только истинную мишень для размножения, даже если она представлена всего в одном-единственном экземпляре на фоне громадного избытка других молекул ДНК. Отметим также, что в отличие от живой природы, где размножение линейных молекул ДНК сопряжено с серьезным проблемами (см. главу 7), в случае ПЦР проблемы концов не возникает из-за того, что используются синтетические ДНКовые праймеры, а не РНКовые праймеры, как при репликации ДНК в клетке. Выбирая число циклов ПЦР, вы можете получить столько копий молекулы-мишени, сколько пожелаете (точнее, пока не исчерпаете дНТФ или праймеры).

За изобретение ПЦР Кари Мулис в 1993 году получил Нобелевскую премию по химии. Изобретение ПЦР повсеместно признано одним из самых главных прорывов в истории ДНКовых технологий, которая (эта история), как мы знаем, богата замечательными открытиями.

Существует две главные причины столь ошеломительного успеха этой, в сущности, крайне простой, если не сказать тривиальной, идеи. Во-первых, и это главная причина успеха, ПЦР работает потрясающе здорово, гораздо лучше, чем Мулис мог мечтать, когда идея впервые пришла ему в голову. Во-вторых, такой замечательный метод размножения ДНК оказался абсолютно незаменимым в бесчисленных биотехнологических приложениях. Если смысл жизни и впрямь состоит в ДНКовой цепной реакции, искусственная жизнь в данную минуту бурно процветает во многих тысячах ПЦР-машин в лабораториях всего мира.

Первыми генной инженерией всерьез заинтересовались фармацевтические фирмы. Для них возможность сравнительно дешево производить практически любые белки в больших количествах открыла совершенно новые горизонты. Ведь помимо того, что белки – основные «рабочие молекулы» в клетке, они играют еще ключевую роль в регуляции процессов, идущих в организме в целом. Почти все гормоны – это небольшие белковые молекулы, содержащие от десятка до нескольких десятков аминокислотных остатков.

Раньше производство гормонов часто было весьма щекотливым делом. Хорошо еще, если, как в случае с инсулином, животный белок (из крупного рогатого скота или свиньи) может служить заменой человеческого гормона. Но во многих случаях это невозможно. Понятно, как фармацевтические фирмы ухватились за новые альтернативы. По их заказу генные инженеры в короткий срок получили штаммы бактерий, вырабатывающие различные человеческие гормоны.