Коллектив авторов - Молекулярная морфология. Методы флуоресцентной и конфокальной лазерной микроскопии

ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЕ КРАСИТЕЛИ И ДРУГИЕ ФЛУОРЕСЦИРУЮЩИЕ ВЕЩЕСТВА, ПРИМЕНЯЕМЫЕ В МОРФОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ

В современных морфологических исследованиях, в случае использования флуоресцентной микроскопии и конфокальной лазерной микроскопии, для окрашивания препаратов применяют различные флуоресцентные красители. При проведении иммуноцитохимических исследований связанные с клеточными и тканевыми антигенами антитела выявляются благодаря включению флуоресцентной метки. Флуоресцирующие вещества, используемые в качестве флуоресцентной метки, присоединенной к нефлуоресцирующим молекулам (нуклеотидам, пептидам, антителам), а также флуоресцентные красители принято называть флуорохромами. Флуоресцентные красители и другие флуорохромы способны расходовать часть энергии поглощенного излучения на флуоресценцию (излучение определенной длины волны) при возвращении из возбужденного состояния в стабильное. Каждый флуорохром обладает индивидуальным спектром излучения и поглощения, наиболее интенсивная флуоресценция наблюдается при облучении красителя светом с длиной волны, близкой к характерному для него максимуму поглощения.

Флуоресцентные красители применяются для выявления биологических макромолекул (белки, нуклеиновые кислоты) или определенных органелл клетки, таких как митохондрии, аппарат Гольджи, эндоплазматическая сеть, а также для выявления клеточного ядра. Для окраски живых объектов применяются такие красители, которые могут проникать в живые клетки, не вызывая их повреждения. Часть существующих красителей (не проникающих в живые клетки либо токсичных для них) используется только для окраски фиксированных биологических объектов. Другие флуоресцирующие вещества (флуоресцентные индикаторы) используются для мониторинга динамических процессов в живых клетках (определение концентрации неорганических ионов, рН, активных форм кислорода и мембранного потенциала). Флуоресцентные красители также широко применяются при определении целостности клеток, при изучении эндо- и экзоцитоза, текучести мембран, межклеточной коммуникации и ферментативной активности клеток. Флуорохромы, взаимодействующие с нуклеотидами, нашли широкое применение в области молекулярной генетики и при проведении цитогенетических исследований.

Использование лазерной конфокальной микроскопии для изучения объектов, подвергнутых окраске флуоресцентными красителями, дает возможность определять локализацию специфических молекул и органелл с высокой точностью. Сочетание нескольких красителей и флуоресцентных меток с различными параметрами излучения позволяет проводить двойную, тройную (и более) маркировку с целью обнаружения нескольких молекулярных компонентов в одном образце.

Некоторые низкомолекулярные органические красители проявляют сродство к определенным биомолекулам и клеточным органеллам. Это явление используется для селективной флуоресцентной окраски. Так, например, амилоидные структуры флуоресцируют при взаимодействии с тиофлавинами (Коржевский Д. Э. [и др.], 2013). Флуоресцентный краситель Нильский красный (Nile Red) используется для определения локализации нейтральных липидных включений в клетках. Nile Red имеет яркую флуоресценцию в неполярных средах (максимумы возбуждения/излучения 552/636 нм). Красители BODIPY также используются при окраске нейтральных липидов. Отложения солей кальция в костях, хрящах и минерализованных опухолях при взаимодействии с тетрациклином проявляют желтую флуоресценцию. Для окраски митохондрий клетки инкубируют с красителями Mitotracker, которые пассивно диффундируют через плазматическую мембрану и накапливаются в митохондриях живых клеток. Помимо митохондриальных маркеров синтезированы также красители Lysotracker, выявляющие лизосомы. Краситель DiOC6 применяется для селективного окрашивания эндоплазматической сети. С аналогичной целью используют соединения из группы ER-Tracker.

Для облегчения идентификации клеток и тканей, а также для определения положения, формы клеток, их апоптозных изменений, фазы митотического цикла в исследованиях, проводимых с применением лазерной конфокальной микроскопии и обычной флуоресцентной микроскопии, используется окраска ядер клеток соответствующими флуоресцентными красителями. Окрашивание ядра клетки значительно облегчает ориентировку в изучаемых препаратах и позволяет регистрировать ряд морфологических параметров, связанных с функциональным состоянием клетки (размеры ядра и ядрышка, состояние хроматина).