Скулачев Петрович - Рассказы о биоэнергетике

Чтобы получить изображение АТФ-синтетазы, нашей сотруднице Л. Бакеевой пришлось использовать практически предельное увеличение, которое позволяет дать электронный микроскоп (около одного миллиона раз). Полученный негатив был затем увеличен еще втрое при изготовлении позитива с электронно-микроскопического снимка. В итоге же изображение оказалось в 3 миллиона (!) раз крупнее действительной величины фотографируемого объекта. Уже одно это число красноречиво свидетельствует, сколь малые размеры выбрала живая природа, создавая биологический генератор тока. А ведь протонная АТФ-синтетаза отнюдь не самый маленький белок-генератор. Бактериородопсин в 20 раз мельче.

Грибовидные выросты на мембране митохондрий были впервые описаны в 1962 году американским микроскопистом X. Фенандес-Мораном. Д. Грин немедленно отреагировал на это открытие гипотезой о том, что в выростах локализуются дыхательные ферменты. Оснований для подобного предположения у него не было, и сейчас уже невозможно понять, что толкнуло автора на поспешную публикацию.

Э. Ракер и Б. Чане взялись проверить гипотезу Грина. Оказалось, что обработка фрагментов митохондрий мочевиной приводит к исчезновению «грибов». Чане измерил (на особом спектрофотометре собственного изобретения) поглощение света мембранами, обработанными мочевиной, и обнаружил в них полный набор дыхательных ферментов, благо все они окрашенные белки с характерными спектральными максимумами. Значит, гипотеза Грина не проходит.

Тогда Ракер решил посмотреть, как обстоит дело с ферментами фосфорилирования. Его логика была примерно такова: раз в «грибах» нет ферментов дыхания, то скорее всего должны быть ферменты фосфорилирования, поскольку эти две группы ферментов — самые массовые в митохондриях. То, что речь идет о каком-то массовом ферменте, было ясно уже из простого просмотра микрофотографий. «Грибов» на мембране такое количество, что между двумя соседними невозможно уместить третий.

В первых же опытах выяснилось, что мембраны, лишенные «грибов», не способны ни к фосфорилированию АДФ, ни к дефосфорилированию АТФ. Стало быть, действительно «грибы» — какая-то деталь фосфорилирующего механизма митохондрий. Но что же происходит с «грибами» под воздействием мочевины?

Известно, что мочевина нарушает многочисленные временные связи, возникающие внутри белков и между белками. Если «гриб» держится за мембрану за счет таких связей, есть шанс, что мочевина не разрушает «грибы», а просто отделяет их от мембраны. Тщательный просмотр микрофотографий убедил Ракера, что в растворе, где находились фрагменты митохондрий, после добавления мочевины появляются сферические частицы диаметром около 85 ангстрем. Центрифугирование всей этой смеси в течение часа при ускорении, в 100 тысяч раз превышающем силу земного тяготения, привело к ее разделению на осадок (в нем были фрагменты мембран) и надосадочную жидкость, содержавшую сферические частицы. Их удалось осадить добавлением соли.

Так в руках Ракера оказалась чистая фракция «грибов». Как показали последующие опыты, «грибы» с большой скоростью расщепляли АТФ до АДФ и фосфата. Более того, добавив «грибы» к обработанным мочевиной мембранам, ученый обнаружил, что на мембране вновь появились грибовидные выросты. При этом возвратилась способность к синтезу АТФ, сопряженному с дыханием.

Определение массы «гриба» показало, что она порядка 385 килодальтон, или в 385 тысяч раз больше массы атома водорода. «Гриб» оказался составленным из нескольких индивидуальных белков с массами от 10 до 55 килодальтон. Еще несколько белков с общей массой порядка 100 килодальтон было обнаружено в мембранной части протонной АТФ-синтетазы. Эти последние нужны для прикрепления «гриба» к мембране и переноса протонов через мембрану. Таким образом, суммарная масса одной молекулы митохондриальной АТФ-синтетазы оказалась чуть меньше 500 килодальтон.

Как же работает этот довольно сложный и внушительный по молекулярным масштабам агрегат?

Рассмотрим сначала реакцию, когда расщепление АТФ ведет к генерации протонного потенциала. Простой опыт показывает, что АТФ взаимодействует первоначально с «грибом», а не с мембранным сектором белкового генератора. Если к митохондриям добавить АТФ, то он не расщепится, пока не пройдет через мембрану и не окажется внутри митохондрии, куда обращены грибовидные выросты.

Ясно также, что гидролиз АТФ происходит в «грибах», поскольку белки мембранного сектора с АТФ не взаимодействуют. Зато они способны к переносу протонов. Эта их активность может быть продемонстрирована, так сказать, в чистом виде на мембранах, лишенных «грибов». Такие мембраны свободно пропускают ионы Н+, причем добавление «грибов» блокирует эту протонную проводимость. Можно нарушить проводимость другим путем — добавлением олигомицина. Кроме того, этот антибиотик прекращает как синтез, так и гидролиз АТФ в исходных мембранах, но не влияет на гидролиз АТФ «грибами», отделенными от мембраны.