Светлана Завалеева - Цитология и гистология

Окрашивание срезов. Срезы окрашивают, чтобы увеличить контрастность различных гистологических структур в препаратах, предназначенных для исследования в световом микроскопе. Разработаны разнообразные методы окраски. В процессе окрашивания происходят сложные химические и физические процессы, поэтому при выборе метода учитывают избирательное сродство структур клетки к определенным красителям с разными физико-химическими свойствами.

Все красители подразделяют на кислые, основные и специальные. Структуры срезов, хорошо окрашивающиеся кислыми красителями, называют оксифильными, основными красителями – базофильными окрашивающиеся как теми, так и другими – нейтрофильными. Специальные красители селективно выявляют конкретные структуры, обладающие сродством к ним. Наиболее широко распространен комбинированный метод окраски тканей – гематоксилином и эозином. Гематоксилин (основной краситель) окрашивает ядра клеток в синефиолетовый цвет, а эозин (кислый) – элементы цитоплазмы в розово-желтый. Окрашенные препараты обезвоживают в спиртах восходящей концентрации (50 %, 70 %, 96 %, 100 %), просветляют в ксилоле или некоторых маслах и затем каждый гистологический срез заключают между предметным и покровным стеклами в канадский бальзам или синтетические смолы. Готовый (постоянный) гистологический препарат можно хранить годами и использовать для микроскопирования.

Методы микроскопии. Основным инструментом для изучения гистологического препарата служит микроскоп – световой или электронный.

Световая микроскопия. С помощыо современных световых микроскопов (МБР-1 – микроскоп биологический рабочий, МБИ-1, МБИ-3 или МББИ – микроскоп бинокулярный биологический исследовательский, ЛЮМАМ и других) можно изучать на срезах строение клеток и тканей. Размер наименьшей структуры, которую можно увидеть в световом микроскопе, определяется наименьшим разрешающим расстоянием (d 0). У современных микроскопов оно составляет около 0,2 мкм. Приближенно разрешение, или разрешающую способность, можно рассчитать по формуле:

где λ – длина световой волны.

Для более точного расчета используют формулу, учитывающую конструкцию объектива:

где n – показатель преломления среды между препаратом и фронтальной линзой объектива;

sin α – синус угла между оптической осью и наиболее сильно отклоняющимся лучом, который еще попадает в линзу объектива.

В микроскопических исследованиях используют следующие единицы измерения:

– 1мкм (микрометр)=1×10 -3мм = 1×10 -6м;

– 1 нм (нанометр) = 1×10 -3мкм = 1×10 -6мм = = 1×10 -9м;

– 1 Å (ангстрем) = 0,1 нм = 1×10 -4мкм = 1×10 -7мм = 1×10 -10м.

Из приведенных данных видно, что разрешающая способность световых микроскопов ограничена десятыми долями микрона (микрометра). Структуры клетки меньшего размера можно рассмотреть только с помощью электронного микроскопа. Подробное описание светового и электронного микроскопов дано в соответствующих руководствах и в курсе физики.

Ультрафиолетовая микроскопия – представляет собой разновидность световой. Длина волны ультрафиолетовых лучей составляет около 0,3 мкм; разрешающая способность микроскопа при иммерсионном объективе приблизительно 0,1 мкм.

Люминесцентная микроскопия основана на том, что многие органические вещества, содержащиеся в клетках, способны светиться (флуоресцировать) при поглощении ими световой энергии. Спектр флуоресценции постоянно смещен в сторону более длинных волн по отношению к изучению, возбуждающему флуоресценцию. Этот спектр лежит в пределах коротких волн (длина от 0,25 до 0,4 мкм). Например, хлорофилл зеленых растений в ультрафиолетовых лучах светится красным светом, а другие вещества – зеленым или желтым (то есть с более короткими волнами). Этот принцип использован при создании люминесцентных микроскопов. Источником света в них служат ксеноновые или ртутные лампы (их спектр близок к ультрафиолетовому излучению), а объект исследуют через специальные фильтры.

Собственной, или первичной, флуоресценцией обладают пигменты (в том числе бактерий), витамины А и В 2, индоламины и некоторые другие вещества. Существует вторичная, или вызванная, флуоресценция. Чтобы ее получить, используют специальные вещества – флуорохромы, которые связываются различными структурами живой клетки и вызывают их флуоресценцию. Например, при обработке срезов тканей флуорохромом акридиновым оранжевым дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) и ее производные приобретают яркозеленое свечение, а рибонуклеиновая кислота (РНК) и ее производные – яркокрасное. Разновидностью вторичной является флюоресценция желто-зеленого цвета, индуцированная парами формальдегида и характерная для катехоламинов (адреналин и норадреналин) мозгового вещества надпочечников. Таким образом, можно исследовать химический состав тканевых структур, выявлять трофические и секреторные включения в клетках.