Журнал Компьютерра - Журнал «Компьютерра» N 33 от 12 сентября 2006 года

Хотя закон природы нельзя нарушить, иногда его можно обойти. И каких только ухищрений здесь ни придумано. В основе большинства из них лежит идея пометить интересующую нас молекулу или другой биологический объект специальными красителями, которые способны светиться - люминесцировать при возбуждении их, например, лазером. А уже с этими светящимися метками проделывают всевозможные хитроумные манипуляции, чтобы определить их положение в пространстве гораздо точнее, чем позволяет дифракционный предел.

Другие методы так называемой микроскопии ближнего поля идейно похожи на туннельный сканирующий микроскоп. В них в качестве зонда используется оптическое волокно, покрытое по краям металлической пленкой. В волокно посылается луч лазера, а сигнал от образца регистрируется либо с помощью обычного микроскопа, либо через это же волокно. Отверстие на конце волокна делают много меньше длины световой волны ["Работает" при этом так называемое ближнее поле], что и обеспечивает локальное сканирование образца. Ясно, однако, что таким грубым зондом можно легко повредить поверхность живого организма, а уж внутрь заглянуть и вовсе проблематично.

В арсенале люминесцентной микроскопии есть интересный метод подавления спонтанного испускания STED (STimulated Emission Depletion microscopy). Молекулы красителя сначала возбуждают лазерным пятном минимально возможного размера. А потом на краях этого пятна возбуждение молекул еще и специально тушат, заставляя их испустить фотон с помощью дополнительного импульса лазера кольцевой формы, который настроен на длину волны люминесценции. И лишь после этих двух импульсов регистрируют свечение возбужденных молекул, оставшихся в центре пятна (рис. 1). Таким способом недавно удалось добиться разрешения порядка 70 нм при использовании возбуждающего лазера с длиной волны 490 нм и тушащего - 575 нм. Известны и другие, еще более изощренные методы оптической микроскопии, основанные на нелинейных оптических или других эффектах. Однако каждый из них имеет те или иные ограничения и пока не удовлетворяет биологов.

Теоретически с помощью обычной оптики можно определить положение одной молекулы, испускающей фотоны красителя, с точностью до размеров самой молекулы. Нужно только регистрировать ее излучение многократно. Тогда суммарное излучение молекулы будет казаться светящимся кругом диаметром порядка длины волны, центр которого определить уже нетрудно.

Но если люминесцирующих молекул много, то излучение от разных молекул перепутывается и мешает установить, какая молекула где находится. И вот теперь мы подходим к ключевой идее новых методов оптической микроскопии. Группа из Гарвардского университета и Медицинского института Говарда Хьюза назвала свою разработку микроскопией стохастической оптической реконструкции (STochastic Optical Reconstruction Microscopy - STORM). А группа из Национального института детского здоровья, Флоридского университета и того же института Хьюза назвала свой вариант микроскопией фотоактивационной локализации (PhotoActivated Localization Microscopy - PALM).

Идея этих методов состоит в том, чтобы многократно облучать образец с молекулами красителя столь слабыми импульсами света, чтобы одновременно возбуждались не все, а только часть далеко отстоящих друг от друга молекул красителя, чьи светящиеся круги не перекрываются. Тогда, делая подряд несколько тысяч измерений, можно довольно точно определить, где и какая молекула расположена. Тут, конечно, требуется сложная компьютерная обработка сразу многих изображений, но это уже дело техники.

Группе из Гарварда удалось добиться пространственного разрешения около 20 нм, что на порядок меньше дифракционного ограничения. И это далеко не предел. Ученые использовали специальные флюорофоры, чьи молекулы можно быстро переключать между возбужденным и «потушенным» состоянием, облучая их импульсами света с разной длиной волны. Эти переключения значительно ускоряют измерения, поскольку уже не нужно ждать, пока все возбужденные молекулы «потухнут» сами. Ученые присоединили флюорофоры к антителам, которые можно подобрать так, чтобы они, в свою очередь, присоединялись к различным биомолекулам. Для исследования одного образца можно использовать целый набор флюорофоров, работающих на разных длинах волн. Каждый флюорофор будет реагировать на свой лазер и присоединяться к своим молекулам или их определенным участкам. Сложив все эти изображения, можно получить цветное изображение спирали ДНК или белковой нити. Исследование одного образца занимает несколько минут, а в ближайшем будущем авторы метода обещают научиться следить за путешествиями молекул внутри клетки даже в реальном времени.