Компьютерра - Журнал «Компьютерра» № 9 от 7 марта 2006 года

Для работы ревертазе требуется так называемая затравка — короткий фрагмент ДНК, заранее прикрепленный к молекуле РНК. Когда ревертаза натыкается на затравку, она «садится» на РНК и ползет по ней в направлении от конца к началу молекулы. При этом ревертаза захватывает из раствора отдельные нуклеотиды и присоединяет их к затравке, тем самым удлиняя цепочку ДНК. РНК при этом играет роль матрицы.

Синтез кДНК мы проведем с помощью набора реактивов SMART, выпускаемого фирмой Clontech (США). Кроме ревертазы и солевого буфера, в котором этот фермент работает, в набор входят также два коротких (длиной около пятидесяти нуклеотидов) фрагмента одноцепочечной ДНК — праймеры. Каждая цепочка синтезированной нами кДНК будет начинаться с одного из этих праймеров и заканчиваться последовательностью нуклеотидов второго праймера. Для чего это нужно, мы скоро узнаем.

У животных все молекулы РНК, кодирующие белок (есть и другие, но сейчас нам это не важно), заканчиваются несколькими десятками идущих подряд нуклеотидов А (поли-А). Благодаря этому мы можем использовать в качестве затравки первый праймер, содержащий комплиментарную последовательность, поли-Т. Присоединяя нуклеотиды к праймеру поли-Т, ревертаза ползет по РНК, синтезируя ее ДНК-копию. Когда ревертаза доходит до самого начала молекулы РНК, происходит еще одно важное для нас событие. Разогнавшийся фермент не останавливается сразу, а достраивает еще три лишних нуклеотида С. Тут в игру вступает второй праймер, до сих пор свободно плававший в растворе. К его концу химически присоединен маленький кусочек РНК, состоящий всего из трех нуклеотидов, G-G-G. Этими нуклеотидами он «прилипает» к свешивающейся с только что синтезированной ДНК последовательности C-C-C, как бы продолжая собой цепочку РНК. Обманутая ревертаза обнаруживает, что матрица еще не кончилась, и достраивает на конце молекулы ДНК последовательность, комплиментарную «прилипшему» праймеру.

Таким образом, мы получили набор одноцепочечных молекул ДНК, комплиментарных РНК коралла, но дополнительно содержащих на концах известные нам нуклеотидные последовательности праймеров (адаптеры). Правда, искать среди этих молекул ген зеленого флуоресцентного белка пока рано, у нас для этого слишком мало материала. Чтобы наработать достаточное количество кДНК, мы воспользуемся одним из самых важных достижений молекулярной биологии — методом полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Белковые молекулы чрезвычайно сложны как по химическому составу, так и по «механической» конструкции. Белок не сможет выполнять свою функцию «молекулярной машины», если в процессе синтеза цепочка составляющих его аминокислот не будет правильным образом уложена (скомпактифицирована) в пространстве.

Изучение компактификации белков — процесса «окончательной сборки» молекул, выражаясь в терминах машиностроения, — является интереснейшей научной задачей, имеющей бесчисленное множество приложений.

Чрезвычайно важно понять, как осуществляется правильная укладка молекулы, где хранится план укладки и где записан технологический процесс компактификации, представляющей собою последовательность операций, каждая из которых должна происходить в свое время и выполняться над соответствующей частью исходной молекулы.

В клетке организма «цехом окончательной сборки» белков является удивительная структура, получившая название шаперон. О работе шаперонов и их устройстве мы знаем не так уж много. Известно, что они обладают потрясающим быстродействием, учитывая сложность выполняемых функций. Их «конструкция» очень сложна. Существует мнение, что в структуре шаперонов каким-то образом записан «чертеж» собираемой молекулы белка, но достоверно мы об этом не знаем. Зато известно, что кроме укладки молекул шапероны способны «ремонтировать» неправильно скомпактифицированные белки, если их структура под влиянием каких-то внешних воздействий будет повреждена.

Так же, как в только что использованной нами реакции обратной транскрипции, основным компонентом ПЦР является фермент — выделенная из бактерий, живущих в горячих источниках, термостабильная ДНК-полимераза. Подобно ревертазе, ДНК-полимераза синтезирует молекулу ДНК, присоединяя отдельные нуклеотиды к затравке комплиментарно матрице, только в качестве матрицы на сей раз используется ДНК, а не РНК. ДНК-полимеразы есть у всех животных (собственно, они необходимы для удвоения ДНК при делении клеток), особенностью же термостабильной полимеразы является ее способность работать при высокой температуре.