Array Британская ассоциация по ветеринарии - Руководство по репродукции и неонатологии собак и кошек

В последнее время достаточно широко применяют тест на целостность мембраны и жизнеспособность спермы (гипоосмотический тест). Тест включает инкубацию спермы в гипоосмотической среде, вызывающей набухание хвоста сперматозоида. Этот тест имеет хорошую корреляцию с подвижностью и жизнеспособностью спермы, но не с ее концентрацией.

Морфологический анализ (МА) служит для определения процента сперматозоидов с нормальным внешним видом либо с помощью фазово-контрастной микроскопии при 200-кратном увеличении, либо с использованием менее мощного микроскопа, но тогда с окрашиванием нигрозин-эозином (см. гл. 8). Морфологические показатели считают нормальными, если процентное соотношение морфологически неизмененных сперматозоидов колеблется в пределах от 65 до 90 %. Минимальный процент морфологически нормальных сперматозоидов, при котором сохраняется нормальная фертильность, для собак не установлен, однако показатель ниже 60 % обычно указывает на нарушения функции тестикул или эпидидимиса. У кобелей в период полового созревания до 40 % сперматозоидов могут иметь проксимальные цитоплазматические включения. Сперма, предназначенная для замораживания, должна содержать не менее 75 % морфологически нормальных сперматозоидов.

Показатель целостности акросом особенно важен для морфологической оценки спермы после размораживания. Для подсчета сперматозоидов с неповрежденной акросомой в лаборатории автора применяют окрашивание раствором Spermac™.

Для искусственного осеменения свежесобранной спермой ее разбавлять необязательно. Однако если предполагается транспортировка спермы и использование через 2–3 часа, ее разбавляют специальными разбавителями и транспортируют при температуре 4 ºС, поскольку такие условия способствуют поддержанию жизнеспособности сперматозоидов. Для транспортировки свежесобранной спермы автор с успехом применяет два вида разбавителей (табл. 9.1 и 9.2).

В эксперименте было проведено сравнение разбавителей, содержащих яичный желток, яичный желток в сочетании со сметаной и яичный желток в сочетании с молоком. Для хранения спермы при 4 ºС лучше всего подходит разбавитель TRIS. Во всех растворах желток предохраняет мембрану сперматозоидов от шока, вызываемого воздействием низкой температуры. Разведение спермы обычно проводят в соотношении 1:6 в зависимости от первоначальной концентрации. Важно, чтобы объем раствора превышал объем спермы, и если при сборе сперму не разделяли на фракции, ее центрифугируют и, удалив излишки секрета предстательной железы, смешивают с раствором.

Пастеризованные сливки 12 % жирности — 8 мл;

Яичный желток 20 % от объема — 2 мл.

Охлаждение при транспортировке обеспечивают, помещая образец в термос, частично заполненный колотым льдом. Для перевозки образца используют пластиковые пробирки для центрифуги (например, пробирку на 10 мл с завинчивающейся крышкой для клеточной культуры).

Пробирку с образцом помешают в изолированную колбу, колбу кладут в термос поверх слоя льда и оборачивают бумагой. Перед осеменением сперму постепенно согревают до 30–35 °C.

В литературе имеется подробное описание множества протоколов разведения, замораживания и размораживания спермы. Автор настоящей главы предпочитает работать с разбавителем TRIS, обеспечивающим хороший результат при хранении спермы собак и лисиц. Успешность последующего осеменения составляет 67–80 % при внутриматочном осеменении с использованием спермы с концентрацией 50–150 х 10 6сперматозоидов в спермодозе и проведением осеменения в два приема с интервалом в 24 часа.

Для замораживания к основному раствору TRIS добавляют глицерин и антибиотики (табл. 9.1). Объем добавляемого глицерина составляет от 12 до 16 мл (6 и 8 % общего объема соответственно) в зависимости от техники замораживания: для автоматического замораживания добавляют 6 % глицерина, для ручного — 8 %. В раствор добавляют дистиллированную воду (188 или 184 мл вместо стандартных 200 мл).

В базовый раствор TRIS с глицерином добавляют 20 % яичного желтка. Яичный желток получают от кур, проверенных на отсутствие патогенных факторов (предназначенных на экспорт или домашних). Желток отделяют от белка, выкладывают на лист чистой бумаги, осторожно прокалывают и сливают в воронку и энергично взбивают стеклянной лопаткой, максимально измельчая его частицы, — это позволяет снизить связывание головок сперматозоидов частицами желтка, затрудняющее анализ спермы. Наконец, желток смешивают с буферным раствором TRIS, предварительно подогретым до 30 ºС. Смесь хорошо взбалтывают и нагревают до 35 ºС. Предварительно приготовленный разбавитель можно замораживать и сохранять в таком виде в течение 2 месяцев. Перед применением его размораживают на водяной бане при температуре 35 ºC.