Ирина Риттер - Дети богов

Бим-бом

Уважаемый Цезарь! Меня интересует вопрос подготовки костей к выделению. Отделяете ли вы остатки мышечной ткани и обрабатываете ли вы кости перекисью? Стоит ли проводить декальцификацию в случаях с гнилыми костями?

Цезарь

От мышечной ткани стараемся избавиться полностью, как и от костного мозга внутри трубчатых костей. Другое дело, когда фрагменты высохших мышц обнаруживаются на внешней поверхности кости. Тогда параллельно выделяем ДНК из кусочков снятых с кости мышечной ткани. Иногда мышца срабатывает и получение ДНК из костной ткани отменяется. Перекисью не обрабатываем. Дистиллированная вода и этиловый спирт. Декальцификацию проводим всегда, с любыми костями.

Первый этап. Выбор кости, из которой будет произведён выпил (или место на кости) и реализация последнего.

Второй этап. Очистка фрагмента кости снаружи и внутри (если трубчатая). Всё под струёй воды в раковине.

Третий этап. Последовательное погружение на несколько минут в каждый раствор фрагмента: в дистиллированную воду – в спирт 96% – в дистиллированную воду.

Четвёртый этап. Высушивание на воздухе 12 часов.

Пятый этап. Дробление кости в ступке из металла (сталь нержавеющая, бронза) до состояния мелких опилок, но не муки.

Шестой этап. Декальцификация и т. д.

Бим-бом

Кости надо перемалывать до стружки? А чем плох порошок?

Цезарь

Порошок плохо оседает при декальцификации, даже при центрифугировании. Кроме того, чтобы добиться состояния порошка, надо либо использовать особые мельницы с охлаждением, либо пилить, что приводит к избыточному разогреванию материала. Удобнее работать с мелкими опилками.

Пастушок

Возможно ли выделить ДНК из обгоревших костей (есть кости черепа, зубы и позвонки) и установить совпадение с родственниками (матерью)?

Панда

Возможно, если в позвонках остался спинной мозг (выделяла фенолом, ДНК целое ведро). Зубы можно, но лезет много лишнего.

Цезарь

Кости могут обгореть в разной степени. Есть варианты, когда генетике делать уже нечего. Иногда ДНК получается из обгоревших костей даже лучше, чем из всякого рода других костей. Надо попробовать на ощупь кости. Если легко крошатся, то и зубы не помогут.

Луч

Вопрос к уважаемому Цезарю. Почему вы отказались от обработки перекисью? В чём смысл обработки этиловым спиртом? Я полагал, что обработка перекисью преследует две цели: во-первых (и главная) избавиться от возможной поверхностной контаминации чужеродной ДНК, во-вторых уничтожение микроорганизмов. Но в чём смысл и задача обработки этиловым спиртом? Вопрос не праздный. Мне приходится работать с фрагментами костей свода черепа. Черепа коллекционные, а значит когда-то вываренные, матриксной ткани мало и меня здорово смущает воздействие на ДНК объекта в губчатой ткани, находящийся между двумя тонкими слоями матриксной кости.

Цезарь

Мы просто исторически никогда не использовали перекись. Кроме мягких, омывающих процедур используются достаточно грубые физические воздействия, когда скальпелем или наждачкой снимается верхний слой костной ткани. Такой метод, вероятно, не подойдёт для рыхлых исторических образцов – там придётся как-то нежно погружать в серию растворов. Во всех остальных случаях нас устраивает конечный результат положительного генотипирования, поэтому мы не меняем сложившуюся методику. Да, спирт. Спирт ведёт к обезжириванию костных фрагментов, что крайне существенно для дальнейшей успешной декальцификации. Мы убираем только часть жиров, но зачастую на поверхности кости их слишком много, чтобы этим пренебрегать. И что может случиться с ДНКой? Она не вымоется спиртом, так как находится внутри клеток, которые не то чтобы оторвать от основы – добраться до них не так просто.

Кости черепа (исключая нижнюю челюсть) самые непростые для выделения ДНК, тем более, когда череп варился. К вам вопрос: какой срок хранения черепов перед ДНК анализом? Каков процент успешного генотипирования? И, если есть какие-то наработки, из каких костей черепа успешнее выделять ДНК?

Луч

Спасибо уважаемому Цезарю за оперативный ответ. Насчёт наработок говорить ещё рано, сделано два черепа. Костный материал был взят из свода черепа. Вначале пытался использовать выпилы из нижней челюсти, но два раза из первой кости получил смесь профилей. Прежде чем отказываться от исследования, взял ещё материал из свода черепа и получил хорошие данные. Второй череп сразу брал из свода черепа. В обоих случаях имелись образцы по одному из ближайших родственников. Профиль получен полный и совпадение с образцами по аллеям как по учебнику. Сегодня взят в работу ещё один череп. Местные криминалисты пугают 105 черепами, накопленными за последний десяток лет.